See this article in English here

Иммунный статус телят из группы риска в период новорожденности и его коррекция

Шахов А.Г., Федосов Д.В., Сашнина Л.Ю., Ерина Т.А.
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии,
фармакологии и терапии Россельхозакадемии»

Введение. Получение и сохранение здорового молодняка сельскохозяйственных животных является одной из наиболее актуальных проблем, успешное решение которой во многом определяет эффективность животноводства. В формировании нозологического профиля болезней новорожденных телят в молозивный и последующие периоды выращивания ведущая роль принадлежит перинатальной патологии (Д.Д. Гамбоев, 1997, Г.А. Тумилович, В.В Малашко, 2008, Ю.Н Алехин, 2013 и др.).

Телят с морфофункциональными нарушениями антенатального (врожденная гипотрофия) и интранатального (асфиксия) происхождения относят к группе риска (Н.В. Валиев, 1974, В.Ф Лысов с соавт., 1988).

Изучению указанных патологий посвящено значительное количество работ, раскрывших их этиологию и патогенез. Показано, что врожденная гипотрофия является компенсаторно-приспособительной реакцией на недостаточное снабжение плода кислородом, питательными и биологически активными веществами или нарушение их усвояемости (Н.В. Валиев, 1974, Б.М. Анохин, 2002, Ю.Н. Алехин, 2013), а интранатальная асфиксия возникает при острой недостаточности или прекращении фетоплацентарного кровообращении при невозможности полноценного запуска легочного дыхания (Ю.Н. Алехин и др., 2012, 2013).

Изучение иммунного статуса телят с синдромом врожденной гипотрофии (А.Г. Шахов с соавт., 2013) показало, что нарушение внутриутробного развития плода сопровождается выраженным снижением у новорожденных уровня гуморальной и клеточной защиты организма и дисбалансом между ключевыми медиаторами, вырабатываемыми различными типами клеток.

В молозивный период у телят-гипотрофиков выявлены более низкие показатели неспеци-фического гуморального (бактерицидная активность сыворотки крови — БАСК, лизоцимная активность сыворотки крови — ЛАСК, комплементарная активность сыворотки крови — КАСК), клеточного (фагоцитарная активность лейкоцитов — ФАЛ, фагоцитарное число — ФЧ, фагоцитар-ный индекс — ФИ) и специфического иммунитета, что указывает на более вероятную возможность возникновения и развития инфекций. На фоне усиления антигенного воздействия у них по сравнению с нормально развитыми животными отмечали заметное снижение уровня IgG в крови, вследствие повышенного его расхода.

Проведенные исследования экспрессии генов в лейкоцитах и концентрации в сыворотке крови цитокинов свидетельствуют о том, что у телят с синдромом гипотрофии в период новорожденности наблюдается острая воспалительная реакция с высоким содержанием провоспалительных цитокинов и сниженной концентрацией регуляторов клеточного и гуморального иммунного ответа, что может приводить к истощению резервных запасов иммунокомпетентных клеток и неспособности адекватно реагировать на проникновение инфекционных агентов в организм телят.

Одной из причин массового заболевания телят-гипотрофиков диареей являлось нарушение морфофункционального состояния и, как следствие, адаптационно-приспособительных реакций организма, что проявилось выраженным угнетением у них факторов естественной резистентности, ставшим пусковым механизмом возникновения желудочно-кишечной и в дальнейшем респираторной патологии.

При изучении иммунного статуса телят, перенесших асфиксию, выявлены более низкие показатели неспецифического гуморального (БАСК, ЛАСК, КАСК), клеточного (ФАЛ, ФЧ, ФИ) иммунитета, уровни в сыворотке крови Ig G, М и титров колостральных антител к бактериальному (Escherichia coli) и вирусному (вирус диареи-болезни слизистых — ВД-БС) антигенам по сравнению с таковыми у телят-норомотрофиков, низкая усваиваемость белков молозива, что свидетельствует о большей восприимчивости их организма к возникновению и развитию инфекций.

Результаты исследований уровня экспрессии генов цитокинов, участвующих в воспали-тельном, клеточно-опосредованном и гуморальном ответе, показали, что у телят, перенесших асфиксию, на протяжении всего периода новорожденности повышается уровень провоспалительного цитокина — интерлейкина-1, при этом у телят-нормотрофиков экспрессия этого цитокина находилась на стабильном уровне. Уровень цитокинов, отвечающих за первичный (гамма-интерферон и ФНО), клеточный (интерлейкин-2, интерлейкин-12) и гуморальный (интерлейкин-4) иммунный ответ, был выше у телят-нормотрофиков. Экспрессия интерлейкина-2, являющегося фактором роста и дифференциации Т-лимфоцитов, активирующего макрофаги и стимулирующего секрецию лимфокинов, и интерлейкина-4, отвечающего за пролиферацию лимфоцитов, активацию макрофагов и выработку антител В-лимфоцитами, у них оставалась выше, чем у животных, перенесших асфиксию.

Полученные данные свидетельствуют о том, что у телят, перенесших асфиксию, в молозивный период медленнее происходит формирование классического клеточного и гуморального иммунного ответа, выше риск возникновения заболеваний, перехода их в хроническое течение (А.Г. Шахов с соавт., 2013).

Таким образом, у телят-гипотрофиков и животных, перенесших интранатальную асфиксию, нарушается становление иммунной системы, играющей основную роль в противовирусной и антибактериальной защите организма, потенциал которой закладывается генетически и начинает формироваться в период внутриутробного развития (Е.С. Воронин с соавт., 2002, J. de Groot et al., 2005).

Для иммунокоррегирующей терапии предложены различные средства и методы, которые по происхождению разделяют на три группы (Д.К. Новиков с соавт., 2002):

1. Биологические, происходящие из клеток и тканей живых организмов (животных, человека, микробов, растений);

2. Химические (природные и синтетические);

3. Физические (лучевая энергия, ультразвук, магнитное поле и др.).

Цель исследований — изучить влияние различных иммунотерапевтических средств на иммунный статус телят с разным морфофункциональным развитием.

Материалы и методы исследований. Для исследований было подобрано 32 новорожденных теленка. Телята после рождения содержались в индивидуальных домиках, в течение 3 дней им выпаивали молозиво (молоко) матери, а затем молоко, подвергнутое сквашиванию (муравьиная кислота). Животные медикаментозному лечению не подвергались.

Телята были разделены на 4 группы (n=8, 4 — с интранатальной асфиксией, 4 — с врожденной гипотрофией).

В качестве иммунокоррегирующих средств применяли «Пролам» и «Иммунофан».

Пробиотик «Пролам» включает жизнеспособные штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (B-5788), Lactobacillus acidophilus 43c (B-3235) в количестве не менее — 5×10⁷КОЕ/см³, молочнокислых стрептококков Lactococcus lactis subsp. lactis 57₄ (B-3145), Lactococcus lactis subsp. lactis 170₄-5 (B-3192)-5×10⁷КОЕ/см³, Bifidobacterium animal 8₃ (AC-1248) -1×10⁷КОЕ/см³ и вспомогательные вещества — воду, мелассу свекловичную, молоко или молочную сыворотку.

Химическое иммунокоррегирующее средство «Иммунофан» представляет собой синтетический гексапептид аргинил-α-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин, включает в состав 0,005% раствор действующего вещества, аминоуксусную кислоту и NaCl.

Животные первой группы — контрольные (интактные) обработкам не подвергались; животные второй группы per os с молозивом получали пробиотик «Пролам» ежедневно в дозе Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (B-5788), Lactobacillus acidophilus 43c(B-3235) в количестве не менее — 3,5×10⁸КОЕ/см³ (колониеобразующих единиц), молочнокислых стрептококков Lactococcus lactis subsp. lactis 57₄(B-3145), Lactococcus lactis subsp. Lactis 170₄-5(B-3192)-3,5×10⁸КОЕ/см³, Bifidobacterium animal 8₃(AC-1248)-7×10⁷КОЕ/см³ в течение 7 суток; телята третьей группы — внутримышечно «Иммунофан» в дозе 50мкг ДВ на животное трехкратно с интервалом в 24 часа, начиная с первого дня жизни; телятам четвертой группы применяли «Пролам» в сочетании с «Иммунофаном» по схемам второй и третьей групп.

В течение 10 дней за животными вели клиническое наблюдение, у них до и по окончании применения препаратов исследовали иммунный статус. Материалом для исследования служили цельная кровь, сыворотка и плазма крови телят.

Бактерицидную, лизоцимную и комплементарную активность сыворотки крови определяли по модифицированным методикам Е.С. Воронина с соавт. (2002). Для исследования БАСК в 4,5мл бульона Хоттингера добавляли 1мл сыворотки и 0,1мл суточной бульонной культуры Escherichia coli, в контрольные пробы вносили только культуру микроорганизма. Содержимое пробирок тщательно перемешивали, в 2мл смеси измеряли оптическую плотность (OD₄₉₀). Смесь, оставшуюся в пробирках, инкубировали в термостате при 37°С в течение 3 часов и повторно измеряли оптическую плотность. Активность определяли в единицах угнетения роста оптической плотности в опытных пробах по сравнению с контрольными.

Для определения ЛАСК к 0,1мл сыворотки крови добавляли 0,4мл 0,06 М фосфатный буфер (рН 7,2-7,4) и 2мл микробной взвеси Micrococcus lysodeicticus оптической плотностью 0,215 OD₅₄₀. Контроль содержал 0,5мл фосфатного буфера и 2мл взвеси микроорганизма, стандартные образцы включали 0,4мл фосфатного буфера, 0,1мл раствора лизоцима с известной активностью и 2мл взвеси микрококка. Пробы инкубировали 30мин при 37°С и измеряли оптическую плотность (OD₅₄₀). Активность лизоцима выражали в мкг/мл.

Для определения КАСК в 5,9мл 0,89% раствора NaCl добавляли 0,1мл сыворотки крови, контрольные образцы содержали 5,9мл бидистиллированной воды. Пробы инкубировали 30 минут при 37°С, контроль при 56°С для инактивации системы комплемента. После инкубации во все пробирки добавляли 4мл приготовленной и прогретой при 37°С в течение 30 минут гемолитическую смесь, содержащую 2,5% раствор эритроцитов барана и кроличью гемолитическую сыворотку. Пробы помещали на 30 минут в водяную баню при 37°С, центрифугировали при 3000об/мин в течение 10 минут. Оптическую плотность супернатанта измеряли при OD₅₂₀. Активность выражали в процентах соотношения оптической плотности опытных проб к контрольным.

Для определения ФАЛ, ФЧ и ФИ к 0,5мл крови, стабилизированной гепарином (5000 Ед/мл), добавляли 0,5мл взвесь Staphylococcus aureus (1,5млрд.мк/мл), инактивированную на водяной бане при 100°С в течение 60 минут. Пробы инкубировали 30мин при 37°С, на обезжиренных стеклах делали мазки в трех повторностях, фиксировали метиловым спиртом и окрашивали азурэозином по Романовскому-Гимзе.

Фагоцитарную активность лейкоцитов выражали процентом активных лейкоцитов (фагоцитов) в 100 подсчитанных нейтрофильных лейкоцитах.

Фагоцитарный индекс являлся средним числом фагоцитированных микробов, приходящихся на один активный лейкоцит. Определяли ФИ путем деления числа фагоцитированных бактерий на число активных нейтрофилов.

Фагоцитарное число определялось отношением фагоцитированных бактерий к общему числу нейтрофилов.

Для определения экспрессии генов рецепторов и цитокинов, участвующих в иммунном ответе (TLR-2, TLR-4, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IL-12p40, TNF-α, INF-γ, TGF-β), к 0,5мл крови, стабилизированной гепарином (5000Ед/мл), добавляли 0,5мл взвеси Staphylococcus aureus или Salmonella dublin (1,5млрд.мк/мл), инактивированные на водяной бане при 100°С в течение 60 минут. Через 24 часа инкубации при 37°С из проб выделяли общую РНК, используя набор РИБО-золь-А (ИнтерЛабСервис, Москва, Россия), кДНК синтезировали при помощи РЕВЕРТА-L (ИнтерЛабСервис, Москва, Россия). Образовавшуюся кДНК в концентрации 200мкг/мл использовали в ПЦР с праймерами, специфичными для искомых генов. Специфику реакции проверяли электрофоретическим разделением продуктов реакции. Уровень экспрессии оценивали при помощи амплификатора ДТ-96 (D. С Werling et al., 2004, R. E. Sacco et al., 2012).

Количественное определение цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, TNF-α) проводили в плазме крови иммуноферментным методом согласно наставлениям к наборам (Вектор-Бест, Новосибирск, Россия). Цельную кровь после суточной активации микроорганизмами центрифугировали при 8000об/мин в течение 10 минут, 0,5мл супернатанта отбирали в чистые пробирки и хранили при −20°С до проведения исследований.

Результаты. У новорожденных телят, полученных от коров при затяжных родах, в первые часы жизни отмечали симптомы интранатальной асфиксии: угнетенное состояние с выраженным цианозом видимых слизистых оболочек, гиперемию десен, ослабленные аппетит и сосательный рефлекс, значительное увеличение частоты пульса 136,0±5,1 ударов и дыхания — 38,0±2,0 в минуту, самостоятельную позу стояния регистрировали лишь через 6,5±2,0 часа.

Постоянные симптомы асфиксии — продолжительная тахикардия и одышка проявлялись 3-4 и 6-7 дней соответственно.

У телят-гипотрофиков были выявлены выраженное торможение физиологических рефлексов, склонность к гипотермии, умеренная тахикардия, тахипноэ, уменьшение дыхательных объемов, длительное сохранение дисбаланса фаз дыхания.

У телят с нормальным уровнем развития указанные показатели находились в пределах референтного диапазона здоровых животных.

У животных всех групп в молозивный период регистрировали диарейный синдром, но количество заболевших, тяжесть проявления и длительность болезни были различны.

В контрольной группе заболеваемость желудочно-кишечными болезнями составила 100% со средней продолжительностью 6,4 дня. Энтеротоксемическую форму колибактериоза регистрировали у 4 телят (50%). У 2-х животных (25%) обнаружен геном ротавируса, болезнь протекала в тяжелой форме. На 9-10 сутки у всех животных выделили геном коронавируса.

В группе телят, которым применяли комплексный пробиотик «Пролам», желудочно-кишечные болезни регистрировали в 62,5% случаев со средней продолжительностью 5 дней. Энтеротоксемическую форму колибактериоза отмечали у 2 животных (25%). В первые сутки у 2-х телят (25%) обнаружен геном ротавируса, болезнь протекала в тяжелой форме.

Рисунок 1.

В группе телят, которым вводили «Иммунофан», желудочно-кишечные болезни в легкой форме регистрировали в 62,5% случаев со средней продолжительностью 4 дня.

Рисунок 2.

У животных, которым одновременно применяли пробиотик и иммуномодулирующее средство, желудочно-кишечные болезни в легкой форме регистрировали в 62,5% случаев со средней продолжительностью 4,4 дня (Рис. 1-2).

При исследовании иммунного статуса установлено, что антигенное воздействие окружающей среды на организм новорожденных животных к 7 суткам у телят контрольной группы привело к снижению БАСК на 12,4%, незначительно количества циркулирующих фагоцитов, их активности (ФЧ на 22,6 и ФИ на 20,6%) и КАСК в 14 раз.

У телят после применения «Пролама» на 7сутки происходило повышение показателей клеточного (ФАЛ на 22,6%, ФЧ на 23,7 и ФИ на 10,8%) и гуморального звена (БАСК на 7,7%) неспецифической защиты, при снижении КАСК в 2,2 раза. При назначении животным «Иммунофана» отмечали аналогичные изменения, которые были более выражены: увеличение ФАЛ на 14,3%, ФЧ в 1,7 раза, ФИ в 1,5 раза, что указывало на высокую активность фагоцитов, бактерицидной активности сыворотки крови на 15,1% и снижение комплементарной активности в 1,7 раза.

Повышение ФАЛ, ФЧ и ФИ, БАСК при снижении КАСК свидетельствовало об активации гуморального и клеточного звеньев неспецифической резистентности.

У телят, получавших «Пролам» в сочетании с «Иммунофаном», регистрировали снижение показателей неспецифической резистентности — БАСК на 6,9%, КАСК в 3,5 раза и ЛАСК на 12,5%, ФИ на 12,9%, связанное с различным воздействием препаратов на иммунную систему новорожденных животных (табл.1).

Таблица 1 — Показатели иммунного статуса телят.

Препараты	БАСК, %		КАСК, % гем.		ЛАСК, мкг/мл		ФАЛ		ФЧ		ФИ
	Возраст, сут.
	1	7-10	1	7-10	1	7-10	1	7-10	1	7-10	1	7-10
«Пролам»	71,1±6,08	76,6± 6,17	10,8±3,4	4,9± 1,11	1,8±0,08	1,7± 0,08	77,2±1,85	88,5± 1,25	5,9±0,64	7,3± 0,71	7,4±0,6	8,2± 0,81
«Иммунофан»	74,2±1,2	85,4± 2,97	17,1±1,18	10,2± 1,31	1,8±0,08	1,7± 0,08	76,7±1,43	87,7± 2,15	4,7±0,11	8,2± 0,77	6,1±0,14	9,2± 0,69
«Пролам» «Иммунофан»	76,5±1,93	71,2± 1,02	14,7±2,61	4,2± 0,45	1,6±0,01	1,4± 0,21	77,2±3,26	89,2± 1,35	6,02±0,47	6,1± 0,55	7,8±0,49	6,8± 0,5
Интактные	77,3±2,19	67,6± 2,3	15,4±0,3	1,1± 0,13	1,6±0,05	1,6± 0,15	78,6±3,81	72,5± 1,25	6,2±0,75	4,8± 0,25	7,8±0,64	6,2± 0,33

 

Таким образом, применение иммунокорректоров способствовали поддержанию уровня естественной резистентности в период адаптации организма новорожденных телят к новым условиям и формированию иммунной системы. У животных, получавших иммунокоррегирующие средства, показатели неспецифической защиты были выше, чем у телят контрольной группы (БАСК на 5,6-26,3%, КАСК в 3,8-9,3 раза, ФАЛ на 17,4 — 20,0%, ФЧ на 21,4 — 41,55%, ФИ на 8,1- 32,6%).

Иммунокоррегирующее действие «Пролама» и «Иммунофана» в отдельности и их сочета-ния оценивали также по влиянию препаратов на синтез и экспрессию генов цитокинов лейкоцитами крови, стимулированными Staphylococcus aureus и Salmonella dublin. Установлено, что к 7 сут-кам у телят всех групп снижалась концентрация α-ФНО, при этом у животных, получавших «Иммунофан» и «Пролам», его концентрация была минимальна, а у телят, которым использовали их сочетание, уменьшение уровня указанного медиатора было менее выраженным, однако количество его был ниже, чем у телят интактной группы (табл.2).

К указанному сроку у животных, получавших «Пролам», «Пролам» в сочетании с «Иммунофаном», и контрольной группы снижалось выделение провоспалительного цитокина — интерлейкина-8, отвечающего за стимуляцию нейтрофилов, что указывает на недостаточную иммунную реакцию на антигенное воздействие. У телят, получавших «Иммунофан», в отличие от животных других групп, воздействие на иммунокомпетентные клетки антигенов Staph. aureus и S. dublin приводило к потенцированию синтеза указанного интерлейкина, что способствовало активации клеточного звена иммунитета.

Таблица 2 — Концентрация цитокинов в сыворотке крови телят при суточной стимуляции лейкоцитов Staphylo-coccus aureus (пг/мл).

Препараты	α-ФНО		ИЛ -1		ИЛ-2		ИЛ-4		ИЛ-8		ИЛ-10
	Возраст, сут.
	1	7-10	1	7-10	1	7-10	1	7-10	1	7-10	1	7-10
«Пролам»	25,3±5,8	0,98± 0,66	4,3±1,79	9,5± 2,92	61,7±25,56	0	0,91±0,38	2,6± 0,42	17,2±4,69	11,3± 1,87	3,3±0,84	3,6± 0,98
«Иммунофан»	18,9±8,61	0	11,5±5,95	17,4± 4,9	31,1±9,06	30,9± 9,02	1,4±0,39	1,8± 0,08	4,8±1,69	16,0± 2,85	3,9±0,14	3,7± 0,04
«Пролам»   Иммунофан»	43,2±2,35	21,3± 9,77	0,37±0,24	6,1± 4,67	21,3±9,94	10,4± 6,14	1,8±0,57	2,4± 0,23	33,4±3,49	14,9± 1,53	2,5±0,9	4,5± 0,42
Интактные	42,3±4,56	26,9± 8,08	1,1±1,03	7,1± 3,19	18,3±8,19	9,9± 6,71	1,8±0,4	1,9± 0,34	21,6±5,31	13,5± 2,59	2,1±1,34	4,5± 0,37

При исследовании содержания интерлейкина-1 при стимуляции клеток антигенами Staph. aureus и S. dublin установлены существенные различия. Воздействие S. dublin на иммунокомпетентные клетки приводило к уменьшению синтеза и выделения медиатора к 7 суткам у телят всех групп, особенно у животных после применения иммунокорректоров. Стимуляция лейкоцитов крови Staph. aureus, напротив, приводило к повышению выделения интерлейкина-1, активация синтеза которого в большей степени проявилась у животных, получавших «Пролам» в сочетании с «Иммунофаном», и у телят контрольной группы. Указанные различия в воздействии Staph. aureus и S.dublin на синтез интерлейкина-1 обусловлены более выраженной чужеродностью антигенов сальмонелл, что способствует быстрому переходу от воспалительной реакции к клеточному иммунному ответу. Об этом свидетельствует увеличение концентрации интерлейкина-2, повышающего цитолитическую функцию Т-киллеров и натуральных киллеров, продукцию перфоринов, участвующих в лизисе бактериальных клеток, и активирующего макрофаги, в ответ на стимуляцию клетками S.dublin. Воздействие стафилококка приводило к снижению выделения цитокина у телят всех групп, кроме животных после применения «Иммунофана», обеспечивающего его количество на том же уровне.

Таблица 3 — Концентрация цитокинов в сыворотке крови телят при суточной стимуляции Salmonella dublin (пг/мл).

Препараты	α-ФНО		ИЛ -1		ИЛ-2		ИЛ-4		ИЛ-8		ИЛ-10
	Возраст, сут.
	1	7-10	1	7-10	1	7-10	1	7-10	1	7-10	1	7-10
«Пролам»	69,9±0,63	19,2± 3,74	47,0±10,3	38,1± 7,98	66,3±15,2	79,6± 20,28	3,9± 0,98	1,7± 0,12	47,6±3,46	37,5± 3,71	0	19,3± 8,18
«Иммунофан»	61,0±2,86	16,5± 2,3	31,1±4,32	17,6± 1,95	97,3±13,76	145,0± 38,2	1,5±0,23	1,1± 0,17	34,5±3,39	42,5± 1,05	1,9±1,85	40,6± 3,65
«Пролам» «Иммунофан»	69,9±3,82	32,1± 4,37	69,0±2,91	26,3± 1,2	68,7±13,88	55,3± 12,35	6,5±0,81	2,5± 0,34	48,4±2,26	41,2± 2,25	1,6±0,81	4,5± 1,32
Интактные	59,1±4,04	46,7± 4,26	58,9±7,26	47,9± 8,58	45,8±9,66	97,5± 23,4	5,0±0,52	4,7± 1,43	43,9±4,78	35,5± 3,42	8,7±3,24	10,9± 6,38

Повышение содержания интерлейкина-2 при стимуляции S. dublin приводило к снижению концентрации интерлейкина-4, отвечающего в большей степени за гуморальный иммунитет и синтез иммуноглобулинов В-лимфоцитами. Активация выделения последнего у телят после проведенной иммунокоррекции при воздействии Staph. aureus объясняется большей частотой и длительностью контакта телят с микроорганизмом и наличием в крови специфических В-клеток и клеток памяти. Повышение содержания интерлейкина-10 у телят всех групп при воздействии антигенов бактерий обусловлено необходимостью снижения воспалительной реакции организма животных на присутствие патогенов. У телят, получавших «Иммунофан», стимуляция Staph. aureus не вызывала подобный эффект, что, при активации выделения интерлейкина-8 и стабильном синтезе интерлейкина-2, свидетельствует о более выраженной клеточной реакции (табл. 3). При исследовании экспрессии генов провоспалительных цитокинов и рецепторов иммунокомпетентных клеток установлено, что у телят после применения коррегирующих средств происходила активация генов, кодирующих Тулл-подобные рецепторы 2 и 4 типов, и провоспалительных цитокинов (интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли).

Рисунок 3. Экспрессия генов цитокинов в лейкоцитах крови телят, получавших «Пролам», после суточной стимуляции антигенами микроорганизмов.

У телят, получавших «Иммунофан», экспрессия генов цитокинов, стимулирующих клеточную реакцию — интерлейкина-8 и интерлейкина-12, была более выражена, чем у животных, которым применяли «Пролам» и «Пролам» с «Иммунофаном», что, вероятно, обусловлено положительным действием «Пролама» на микробиоценоз кишечника, способствующим коррекции иммунитета, направленной на уменьшение роли клеточного и увеличение гуморального иммунного ответа (рис. 3-6).

Рисунок 4. Экспрессия генов цитокинов в лейкоцитах крови телят, получавших «Иммунофан», после суточной стимуляции антигенами микроорганизмов.

Рисунок 5. Экспрессия генов цитокинов в лейкоцитах крови телят, получавших «Пролам» и «Иммунофан», после суточной стимуляции антигенами микроорганизмов.

У телят интактной группы экспрессия генов провоспалительных цитокинов и рецепторов в ответ на стимуляцию антигенами микроорганизмов была ниже, чем у животных, которым применяли иммунокорректоры, что свидетельствует о менее выраженной реакции на антигенное воздействие.

Рисунок 6. Экспрессия генов цитокинов в лейкоцитах крови телят контрольной группы после суточной стимуляции антигенами микроорганизмов.

Выявленный менее существенный ответ лейкоцитов крови на воздействие стафилококка, проявляющийся более низким синтезом и выделением цитокинов и экспрессией генов при снижении факторов неспецифической резистентности, может приводить к торможению иммунной реакции на возрастающую антигенную нагрузку.

Обсуждение

Проведенными исследованиями по стимуляции и коррекции становления иммунитета у телят из группы риска в молозивный период установлено, что применение биологических («Пролам») и синтетических («Иммунофан») иммунокорректоров способствовало лучшей адаптации новорожденных к изменению окружающей среды, возросшей антигенной нагрузке и формированию адекватного иммунного ответа.

Использование «Пролама» способствовало циркуляции количества активных нейтрофилов в кровяном русле, увеличению их поглотительной способности и бактерицидности сыворотки крови, что указывает на активацию неспецифической резистентности.

Пробиотики, содержащие в своем составе комплекс из разных видов индигенной микрофлоры, в частности, таких как лактобациллы, лактококки и бифидумбактерии, способствуют не только поддержанию нормального микробиоценоза открытых полостей, но и обладают выраженным иммуностимулирующим действием. Установлено, что отдельные штаммы этих микроорганизмов могут заметно увеличивать фагоцитарную способность макрофагов, потенцировать продукцию интерлейкинов, интерферона и других медиаторов, то есть повышать неспецифическую иммунорезистентность (Д.С. Янковский, 2005).

С другой стороны доказана роль лактобацилл в снижении воспалительных процес-сов в ответ на инфицирование вирусами и защите тканей и клеток эпителия кишечника и верхних дыхательных путей от их повреждающего действия (A.R. Lomax, Calder P.C, 2009, H.F. Rosenberg, 2012). Более того, S.J Gabryszewski et. al. (2011) показали высокую эффективность лактобацилл в угнетении вирус-индуцированного воспаления и неконтролируемого синтеза интерлейкинов («цитокиновый шторм») за счет снижения поступления гранулоцитов в инфицированные ткани.

Проведенными нами исследованиями установлено, что у телят, получавших «Пролам», стимуляция лейкоцитов крови стафилококками и сальмонеллами приводила к уменьшению выделения провоспалительных цитокинов (TNF и IL-8) при достаточно высокой экспрессии их генов, повышению синтеза IL-10, связанного с необходимостью снижения воспалительной реакции. Однако, в отличие от воздействия сальмонелл, приведшее к росту уровня IL-2, стимуляция стафилококками увеличивала концентрацию IL-1β, в данном случае способствующего дифференцировке клеток, и IL-4, направляющего развитие гуморального иммунитета по Th2 пути.

Исследованиями А.Ю. Миронова с соавт. (2011) установлена высокая способность лактобацилл к организации биопленок на слизистых, их взаимодействие с иммунной системой кишечника. Пробиотические бактерии активно участвуют в формировании ранней защиты от инфекций, повышая концентрацию секреторного IgA, фагоцитарную активность иммунокомпетентных клеток, бактерицидную, лизоцимную и комплементарную активность сыворотки крови (Л.В. Жичкина, 2010, А.Н. Панин, 2011). Отдельные препараты из пробиотиков уже предлагаются для иммунокоррекции (В.М. Бондаренко, 1998, S. Blum et al., 1999, H.S.Gill et al., 2000).

Другими известными иммунокорректорами и иммуномодуляторами являются синтетические пептиды, которые, по мнению некоторых исследователей, эволюционно раньше возникли в качестве сигнальных молекул, чем другие медиаторы межклеточных взаимодействий (В.Х. Хавинсон, В.В Малинин, 2002). Применение новорожденным телятам аминокислот повышает интенсивность всасывания иммуноглобулинов молозива, ускоряет становление естественной резистентности (Л.В. Харитонов, 2006). Преимущество пептидов перед препаратами аминокислот заключается в их большей устойчивости к расщеплению, что важно при парентеральном введении (Л.В. Харитонов, 2012). Использование синтетических иммунокорректоров на основе олигопептидов, содержащих от 2 до 6 аминокислот, способствует активации фагоцитов, их микробной емкости, повышению адгезии лейкоцитов и выработке ими активных форм кислорода при контакте с опсонизированными фрагментами микроорганизмов (Д.К. Новиков, 2002, Л.В Харитонов, 2012).

Проведенными нами исследованиями установлено, что иммунокоррегирующее действие «Иммунофана», в отличие от «Пролама», в большей степени было направлено не на увеличение количества фагоцитов в кровяном русле, а на повышение их активности и агрессивности. Об этом свидетельствует и снижение комплементарной активности сыворотки крови, отмеченное у животных всех групп, которое у получавших «Иммунофан» телят было менее выраженным.

Применение препаратов сопровождалось повышением активации фагоцитов, в результате чего комплемент расходовался в меньшей степени, чем у телят контрольной группы. Для нестимулированных фагоцитов необходимо большее участие белков системы комплемента для лизиса бактериальных клеток и проникновения в них белков, способствующих их разрушению.

Применение «Иммунофана» новорожденным телятам приводило к прекращению синтеза лейкоцитами TNF и увеличению выделения IL-1 при стимуляции стафилококками, но в меньшей степени, чем у животных обработанных «Проламом». Вместе с тем при менее выраженном увеличении синтеза IL-4, количество выделяемого IL-2 оставалось на том же уровне, а IL-8 в значи-тельной степени возрастало, что свидетельствует о превалировании Th1 пути иммунного ответа и большей активности макрофагов. Стимуляция лейкоцитов сальмонеллами, также как и у получавших «Пролам» телят, приводила к увеличению количества IL-10, уменьшению синтеза провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1) и IL-4, при этом снижение последнего у животных, обработанных «Иммунофаном», было менее выраженным. Также у них в большей степени возрастал синтез IL-2 и стимулировалось выделение IL-8, содержание которого у телят, получавших «Пролам», снижалось.

У телят, обработанных «Проламом» в сочетании с «Иммунофаном», стимуляция лейкоцитов стафилококком приводила к таким же изменениям, что и у животных, получавших «Пролам». Однако у них в меньшей степени снижалось выделение TNF и более выраженно — IL-8, что может свидетельствовать о низкой активности макрофагов, значительное возрастание содержания синтезируемого IL-1, вызывало сравнительно большее увеличение количества вырабатываемого лейкоцитами IL-10, необходимого для купирования воспалительного процесса. Также у телят этой группы медленнее осуществлялся переход от Th1 к Th2 пути иммунного ответа. При инкубации цельной крови с сальмонеллами отмечали снижение выделения всех исследованных цитокинов, за исключением IL-10, увеличение синтеза которого было ниже, чем у животных, получавших «Пролам» и «Иммунофан» в отдельности.

Отмеченная разница в продукции цитокинов стимулированными микроорганизмами лейкоцитами при применении пробиотика и синтетического иммунокорректора объясняется действием препаратов на различные звенья и факторы иммунной системы. Микроорганизмы, входящие в состав «Пролама», участвуя в формировании кишечного биоценоза, на ранних этапах становления иммунной системы являются первичными антигенами для нативных лейкоцитов, стимулирующими их пролиферацию и активацию, что способствует более быстрому развитию иммунного ответа при контакте с чужеродными бактериями преимущественно по Th2 пути. «Иммунофан», являясь олигопептидом, скорее выступает в роли вспомогательной сигнальной молекулы при взаимосвязи между иммунокомпетентными клетками, при этом его действие на макрофаги/фагоциты приводит к возрастанию их активности и агрессивности без увеличения количества клеток, что снижает нагрузку на костный мозг, усиливает пролиферацию Т-лимфоцитов, стимулирует продукцию IL-2. Следовательно, его применение способствует развитию иммунного ответа по Th1 пути. Использование сочетания «Проламома» и «Иммунофана» сопровождалось одновременной активацией Th1 и Th2 путей, что привело к снижению интенсивности иммунной реакции в ответ на действие антигенов.

Выводы.

Проведенными исследованиями установлено, что применение иммунокоррегирующих средств новорожденным телятам из группы риска способствовало формированию более адаптивного иммунного ответа на антигенное воздействие в период становления иммунной системы. Однако при обработке животных иммунотерапевтическими средствами различного происхождения следует учитывать механизмы их действия и точки приложения для разработки и усовершенствования схем коррекции иммунитета.

Список литературы.

1. Алехин Ю. Н. Причины возникновения асфиксии у новорожденных телят/ Ю.Н. Алехин, И.Р. Сидельникова// Ветеринария сельскохозяйственных животных.-2012.- № 12. — С.33-35.

2. Алехин Ю. Н. Перинатальная патология у крупного рогатого скота и фармакологические аспекты ее профилактики и лечения: автореферат дисс.... докт. вет. наук.- Воронеж, 2013. 45с.

3. Анохин Б.М. Причины болезней молодняка, диагностика, меры борьбы.- М.: МЭИНФ.- 2002.- 191с.

4. Бондаренко В.М., Рубакова Э.И., Лаврова В.А. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов-пробиотиков// Ж.микробиолю, эпидемиол., иммунол.- 1998.-№ 5.-С.107-112.

5. Гомбоев Д. Д. Неонатальная незрелость телят и ее последствия // Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных: сб. науч. тр. Новосибирск, 1997, С. 340-341.

6. Валиев Н.В. Клинико-гематологические исследования при антенатальной гипотрофии поросят: автореферат дисс....канд. вет. наук. — Казань. 1974. 28с.

7. Воронин Е.С., Петров А.М., Серых М.М., Дервишев Д.А. Иммунология/ Под ред. Е.С. Воронина.- М.: Колос — Пресс, 2002.408 с.

8. Жичкина Л.В. Косумов М.К. Марцинковская И.В. Панкреатит и дисбактериоз у кошек и собак. // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. — 2010. — № 3 (7). — С. 42-46.

9. Лысов В.Ф., Замарин Л.Г., Чернышов И.А. Здоровый молодняк — основа высокопродуктив-ного стада.- Казань: Татар., кН. изд-во.1988. 165с.

10. Миронов А.Ю. Генетическая паспортизация и изучение способности к формированию био-пленок лактобациллами, выделенными из полости рта здоровых людей / А.Ю. Миронов, Гаврилова, В.М. Червинец и др. // Клиническая лабораторная диагностика. — 2011. — № 2. — С. 44-46.

11. Новиков Д.К., Сергеев Ю.В., Новикова В.И. Характеристика иммунофармакотерапевтиче-ских препаратов // Иммунопатология, аллергология, инфектология. — 2002. — № 4. — С. 7-27.

12. Панин А.Н. Пробиотики в животноводстве — состояние и перспективы/ А.Н. Панин, Н.И. Малик, О.С. Илаев // Ветеринария.- № 4.- С.3-8.

13. Тумилович Г.А. Морфофункциональные особенности и зоотехнические показатели антенатального недоразвития телят / Г.А. Тумилович, В.В. Малашко // Сельское хозяйство — проблемы и перспективы: сб. науч. тр. / Гродн. гос. аграр. ун-т. Гродно, 2008. Т. 2. С. 119–125.

14. Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Механизм геропротективного действия пептидов (обзор). Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2002. — № 1. — С. 4-12.

15. Харитонов Л.В., Кузнецов И.Л., Пронькина Е.А., Великанов В.И. Влияние препаратов аминокислот на функциональное состояние и неспецифическую резистентность телят. Труды ВНИИФБиП с.-х. животных, Боровск. — 2002. — № 41. — С. 83-96.

16. Харитонов Л.В., Ванюхин В.В., Великанов В.И., Шумов И.С., Маслова М.А. Участие амино-кислот в формировании естественной резистентности телят. Материалы 4-й международ-ной конференции: Актуальные проблемы биологии в животноводстве. Боровск. — 2006. — С. 348-349.

17. Харитонов Л.В., Морозов А.Н., Харитонова О.В. Влияние тимогена на становление неспецифической резистентности у телят-молочников. // Проблемы биологии продуктивных жи-вотных. — 2012. — № 2. — С. 42-48.

18. Шахов А.Г. Особенности защитных систем у телят с синдромом гипотрофии и их роль в развитии неонатальной патологии/ А.Г. Шахов, Д.В. Федосов, Л.Ю. Сашнина и др.// Ветеринарный врач. 2013.- № 2.- С.27-30.

19. Шахов А.Г. Формирование иммунного статуса у перенесших интранатальную асфиксию новорожденных телят/ А.Г. Шахов, Д.В. Федосов, Л.Ю. Сашнина и др.// Вестник РАСХН.- № 2.- 2013.- С.73-76.

20. Янковский Д.И. Микробная экология человека: современные возможности ее поддержания и восстановления.- К..:, Эксерт ЛТД, 2005.- 362 с.

21. Blum S., Alvarez S., Haller D. et al. Intestinal microflora and the interaction with immunocompetent cells // Ant. Leewen. — 1999. — V.76. — P.199-205

22. Gabryszewski S.J., Bachar O, Dyer K.D., Percopo C.M., Killoran K.E., Domachowske J.B., Ros-enberg H.F. Lactobacillus- mediated priming of the respiratory mucosa protects against lethal pneumovirus infection. J Immunol. 2011;186 (2): 1151-1161. [РubMed: 21169550].

23. Gill H.S., Rutherfurd J., Prassad J., Gopal P.K. Enhancement of natural and acquired immunity by Lactobacillus rhamnosus (HN001), Lactobacillus acidophilus (YN017) and Bifidobacterium lactis (HN019) // Brit. J. Nutr. — 2000. — V.83 (2). — P.167-176.

24. Groot J. de, Kruijt L.W., Boersma W.J.A. Buist W.G., van Reenen C.G. Age, gender and litterrelated variation in T-lymphocyte cytokine production in young pigs // Immunolo-gy.2005.V.114.P495-505.

25. Lomax A.R., Calder P.C. Probiotics, immune function, infection and inflammation a review of the evidence from studies conducted in humans. Curr Pharm Des. 2009; 15 (13):1428 — 1518.[РubMed: 19442167].

26. Rosenberg H. F., Domachowske J. B. Inflammatory responses to Respiratory Syncytial Virus (RSV) infection and the development of immunomodulatory pharmacotherapeutics. // Curr Med Chem. — 2012. — V.19 (10). — P.1424—1431.

27. Sacco R.E., Nonnecke B.J.,. Palmer M. V, Waters W. R., Lippolis J. D., Reinhardt T. A.. Differen-tial Expression of Cytokines in Response to Respiratory Syncytial Virus Infection of Calves with High or Low Circulating 25-Hydroxyvitamin D3. // PLoS. 2012, vol. 7, Is. 3, e33074.