Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
УРАЛЬСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

Утверждено
Проректор по научной работе
доктор медицинских наук, профессор
О.П. Ковтун
Научный руководитель
доктор медицинских наук, профессор
О.Г. Макеев

Екатеринбург 2009г.

Отчет
о научно-исследовательской работе
Создание линии культивируемых клеток эмбриона курицы.
Исследование эффектов пробиотика (Моноспорин) и антибиотика (Энроколи), используемых в технологических схемах выращивания молодняка, на культивируемой линии клеток эмбриона курицы.

(заключительный)

Введение

Технология интенсивного птицеводства предполагает содержание большого поголовья птицы на ограниченных площадях. Последнее сопряжено с угрозой возникновения и быстрого распространения инфекционных заболеваний и массового падежа птиц. Основная причина гибели — желудочно-кишечные заболевания (свыше 50% от общего падежа) [2, 5].

В настоящее время одним из путей профилактики желудочно-кишечных заболеваний является добавление в корм антибиотиков широкого спектра действия и (или) пробиотиков — культур непатогенных микроорганизмов, тем или иным способом подавляющих рост патогенной флоры. [1, 4, 6, 8].

Одним из пробиотиков, хорошо зарекомендовавших себя в птицеводстве, являются пробиотики на основе В.Subtilis [9, 10, 11, 12].

Последние, наряду с низкой токсичностью, эффективно защищают молодняк от широкого спектра патогенных микроорганизмов путем синтеза разнообразных бактерицидных веществ и, наряду с этим, образуют большое количество факторов, обеспечивающих интенсивный рост и развитие цыплят.

Вместе с тем, применение данного пробиотика не гарантирует защиту от массированного поступления патогенных микроорганизмов в современных условиях птицеводства и тем более в условиях трансовариального заражения цыплят. Это диктует необходимость применения антибиотиков широкого спектра действия, в частности ЭНРОКОЛИ. Данный препарат представляет собой комбинацию двух антибиотиков с различным механизмом действия — энфрофлоксицина — препарата фторхинолинового ряда и колистина — продукта жизнедеятельности B.Polymyxa, нарушающего проницаемость бактериальной стенки. Среди ряда современных антибиотиков, применяющихся в ветеринарии, Энроколи является наиболее эффективным по показателю соотношения токсичность/бактерицидность [2, 5]. Вместе с тем, в настоящее время Энроколи постепенно утрачивает свою эффективность по мере развития устойчивости патогенных микроорганизмов к энфрофлоксицину. Последнее обусловлено сложностью дозирования препарата в условиях промышленного птицеводства. Кроме того, компоненты антибиотика высоко токсичны для человека, [15], что обуславливает запрет на использование для пищевых целей продуктов птицеводства ранее, чем через 9 суток после окончания применения данного препарата, что создает условия для массового инфицирования птицы в данный временной промежуток [13].

В связи с этим, с целью эффективной профилактики инфекционной патологии у птиц в условиях современного птицеводства наиболее перспективным является комбинирование анти- и пробиотиков. Однако данные об исследованиях подобного рода в доступной литературе практически отсутствуют.

Ранее в подобных работах традиционно использовались модельные эксперименты на животных. В тоже время, наиболее отвечающим современным требованиям является метод культуры клеток. Главное преимущество применения метода — возможность прижизненного наблюдения клеточного метаболизма. Так же существенно, что при работе с культурами клеток в эксперименте используются кондиционированные клетки, сохраняющие жизнеспособность в течение всего эксперимента. Генетическая однородность популяции клеток, постоянство условий их роста позволяют оценивать влияние на рост клеток самых различных факторов — рН, температуры, концентрации аминокислот, витаминов, антропоэкологических факторов с оценкой роста культуры в течение любого периода времени. Приведенные преимущества культуральных методов в сравнении с исследованиями in vivo, дают основания для предпочтения применения клеточных культур в качестве экспериментальной модели.

В связи с изложенным, в настоящей работе было исследовано влияние антибиотика Энроколи и факторов, секретируемых В.Subtilis, на модели ранее полученной линии эмбриональных клеток курицы.

Материалы и методы исследования

Культивирование В.Subtilis.

Культура любых эмбриональных клеток, в том числе эмбриональных клеток курицы (ЭКК), весьма чувствительна к составу среды инкубации. Для нивелирования эффектов транспортной среды, В.Subtilis, на предварительном этапе было выполнен пересев В.Subtilis на среду, используемую для выращивания ЭКК.

С этой целью из предоставленного Заказчиком препарата, содержащего В.Subtilis, после интенсивного встряхивания были отобраны пробы объемом 10мл, которые затем были отцентрифугированы. Супернанат был отброшен, а к осадку добавлен буферный раствор, в котором бактерии были ресуспендированы и вновь отцентрифугированы при тех же условиях. Данный этап повторяли трижды.

По завершении отмывки, осадок вновь ресуспендировали и, с целью контроля жизнеспособности В.Subtilis, часть взвеси высевали на Agar L3147 (рис.1), другую часть помещали в среду, содержащую D-МЕМ (Sigma), Ham’s F-10 (MP Biomedicals) и фетальную бычью сыворотку степени очистки defined (HyClone, США).

Рис 1. Рост выделенных культур B.Subtilis.
Нативный препарат.

Через 3 часа культивирования (фаза интенсивного роста) образцы центрифугировали.

С целью оценки адекватности культуральной среды, часть культуры наносили на предметное стекло, фиксировали метанолом, окрашивали по Граму и микроскопировали (рис 2).

Рис. 2. Рост B.Subtilis в среде, состоящей из D-МЕМ, Ham’s F-10, и FBS.
Окраска по Граму.

Супернатант, содержащий факторы, выделяемые В.Subtilis, стерилизовали путем фильтрации через ацетат-целлюлозный фильтр Sarstedt, Германия) и использовали в дальнейшем для изучения влияния продуктов жизнедеятельности В.Subtilis на рост и развитие ЭКК.

Культивирование эмбриональных клеток куриц.

Культивирование ранее выделенных и замороженных ЭКК проводили в инкубаторе Sanyo (Япония). Культуральную среду меняли 1 раз в 3 дня. Ежедневно производили микроскопический контроль за состоянием культуры с использованием инверсионной микроскопии (рис 3).

Рис 3. Культура ЭКК, увеличение х400

Оценка влияния продуктов В.Subtilis

Для оценки влияния продуктов, синтезируемых В.Subtilis во время роста, ЭКК инкубировали в стандартной среде с добавлением стерилизованного супернатанта культуры роста В.Subtilis в соотношении 1/99, 10/90, 20/80, 30/70 (первая цифра — объем супернатанта культуры роста В.Subtilis, вторая — объем культуры ЭКК).

С целью изучения влияния антибиотика с торговой маркой «Энроколи» (SL España), последний добавляли в среду инкубации ЭКК в количестве 0,1, 0,25, 2,5 и 25мкг/мл среды.

Совместное влияние изучаемых препаратов исследовали посредством внесения в культуральную в среду ЭКК вносили обоих препаратов по схеме, представленной в таблице и проводили сравнение с показателями контрольной культуры (без добавления данных веществ).

Подсчет клеток производили на гематологическом анализаторе. После подсчета взвесь клеток заливали в вентилируемые культуральные матрасы (Sarstedt, Германия) и помещали в СО₂-инкубатор. Дальнейшее культивирование проводили при тех же условиях (смена среды, визуальный контроль) с пассажами клеток на матрасы, имеющие большую площадь. Культуру ЭКК выращивали до получения требуемой клеточной массы. По завершении культивирования клетки трипсинизировали, отмывали и использовали для исследования.

Синтетическую активность ЭКК оценивали по включению в макромолекулы меченых селективных предшественников синтеза ДНК (2¹⁴С-тимидин), РНК (¹⁴С-уридин) и белка (³Н-лейцин).

Радионуклиды вносили на матрасы одновременно с ЭКК из вторичной 6-ти суточной культуры. Эксперимент прерывали через трое суток культивирования, клетки снимали с матрасов раствором трипсина-версена (Sigma) по стандартной методике и подсчитывали на гематологическом анализаторе. Подсчет радиоактивности производили в спиртотолуоловом сцинтилляторе на жидкостном сцинтилляционном счетчике Бета-2. Результаты выражали в беккерелях на 10⁶ клеток.

Статистическая обработка проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 3.04. Результаты считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Внесение в культуру ЭКК среды, содержащей продукты жизнедеятельности B.Subtilis, сопровождается статистически достоверным изменением активности клеток в отношении синтеза ДНК (табл.№1, рис.4), причем в интервале соотношения объемов культур 1/99 — 20/80 наблюдается стимуляция синтеза ДНК (до 38,89%). Дальнейшее увеличение концентрации продуктов жизнедеятельности бактерий вызывает достоверное угнетение синтеза ДНК (на 11%).

Вероятно, последнее связано с образованием B.Subtilis веществ, обладающих способностью угнетать пролиферацию не только микроорганизмов, но и ЭКК. Однако данный эффект проявляется лишь при замещении среды инкубации ЭКК средой кондиционированной B.Subtilis на треть по объему.

Таблица 1 — Влияние продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика Энроколи на включение 214С-тимидина в ДНК эмбриональных клеток курицы в условиях культуры.

Примечание * — достоверное отличие от контроля (без добавления среды роста B.Subtilis и антибиотика.
# — достоверное отличие включения 2¹⁴С-тимидина в ДНК в культуре с добавлением среды роста B.Subtilis и антибиотика от культуры только с добавлением антибиотика в соответствующей концентрации.

Здесь и далее достоверным считали отличие при р<0,05.

Рис. 4. Динамика изменения синтеза ДНК под влиянием продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика.
Данные представлены в процентах от контроля.

Следует отметить, что угнетение синтеза ДНК при добавлении значительного объема кондиционной среды B.Subtilis не может быть объяснено возникающим вследствие разведения дефицитом факторов роста ЭКК, поскольку бактерии инкубировали в среде идентичной по составу среде культивирования ЭКК.

Внесение в культуру ЭКК антибиотика Энроколи в диапазоне концентраций 0,1–25мкг/мл вызывает стойкое угнетение включения селективной метки в ДНК (на 20% уже при концентрации 0,1мкг/мл и на 93,89% — в максимальной концентрации). Последнее можно объяснить присутствием в составе Энроколи энфрофлоксицина — препарата фторхинолинового ряда, механизм действия которого заключается в ингибировании синтеза ДНК.

Привнесение в среду продуктов роста бактерий, обладающих стимулирующим эффектом в отношении синтеза ДНК, несколько улучшает ситуацию. Так, при концентрации антибиотика 0,1мкг/мл применение кондиционированной среды B.Subtilis в соотношении 10/90 угнетения синтеза ДНК не наблюдалось (данные не отличались от контроля). Однако при остальных концентрациях угнетающий эффект антибиотика сохранялся, хотя и был выражен в меньшей степени. Вероятно, синтезируемые бактериями вещества способны либо реактивировать топоизомеразы, блокируемые фторхинолинами, либо бактерии синтезируют вещества, способные «расплетать» двойную цепочку ДНК, оказывая топоизомеразоподобный эффект [16]. По крайней мере, феномен устойчивости к антибиотикам данного ряда рассматривается в настоящее время как многостадийный процесс, включающий в себя, помимо перечисленных, снижение поступления антибиотика внутрь клетки и его ускоренную внутриклеточную деградацию [14].

Анализ данных влияния изучаемых веществ на включение радиоактивно меченого предшественника синтеза РНК ¹⁴С-уридина продемонстрировал в целом сходную картину (таб.№ 2, рис. 6) с той лишь разницей, что выявленные на примере синтеза клетками ДНК эффекты были более выраженными. Так, продукты жизнедеятельности бактерий вызывали увеличение синтеза РНК на 50–80%, а в максимальной концентрации не оказывали ингибирующего эффекта. Более того, наблюдалась некоторая тенденция к стимуляции (на 33%), однако отличие от контроля оказалось недостоверным. Возможно последнее обусловлено тем, что B.Subtilis активно продуцирует инозин. Эта особенность бактерий применяется для производства последнего в промышленных целях [3].

В тоже время хорошо известно, что анаболический эффект инозина обусловлен его участием в синтезе РНК, а так же тем, что инозин является кофактором транскрипции [7].

Таблица 2 — Влияние продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика Энроколи на включение ¹⁴С-уридина в РНК эмбриональных клеток курицы в условиях культуры.

Примечание * - достоверное отличие от контроля (без добавления среды роста B.Subtilis и антибиотика).
# - достоверное отличие включения ¹⁴С-уридина в РНК в культуре с добавлением среды роста B.Subtilis и антибиотика от культуры только с добавлением антибиотика в соответствующей концентрации.

Таблица 3 — Влияние продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика Энроколи на включение ³Н-лейцина в белок эмбриональных клеток курицы в условиях культуры.

Рис 5. Динамика изменения синтеза РНК под влиянием продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика. Данные представлены в процентах от контроля.

Поскольку механизм действия исследуемого антибиотика по-видимому заключается в блокировании топоизомераз, то наряду с нарушением репликации ДНК так же будет наблюдаться и нарушение транскрипции. Полученные данные в полной мере соответствуют этому предположению. Так, добавление антибиотика в культуральную среду сопровождалось дозозависимым подавлением синтеза РНК на 47–87%%.

Как и в исследовании синтеза ДНК, привнесение продуктов жизнедеятельности бактерий в культуру ЭКК с добавлением антибиотика лишь в некоторой степени улучшало картину. Анализ данных, полученных при изучении эффектов продуктов B.Subtilis и антибиотика Энриколи на синтез эмбриональными клетками курицы белка позволил установить, что тенденция, выявленная в отношении синтеза нуклеиновых кислот, в целом сохраняется.

Продукты жизнедеятельности B.Subtilis в зависимости от концентрации, оказывают стимулирующий эффект на синтез белка ЭКК (табл.3, рис. 6).

Рис 6. Динамика изменения синтеза белка под влиянием продуктов жизнедеятельности B. Subtilis и антибиотика. Данные представлены в процентах от контроля.

Вместе с тем, выявленная зависимость не является линейной. Так, в диапазоне соотношения объемов кондиционная B.Subtilis культура/культура ЭКК 1/99, 10/99 наблюдается рост стимулирующего эффекта продуктов жизнедеятельности B.Subtilis в отношении включения меченого лейцина в белок (на 34 и 54%% по сравнению с контрольными величинами соответственно). В диапазоне соотношения объемов 20/80 и 90/80 наблюдается снижение стимулирующего эффекта (до 17%).

Следует отметить, что зарегистрированная стимуляция синтеза белка не может быть объяснена образованием бактериями аминокислот, так как среда ДМЕМ содержит их в избыточном количестве.

При добавлении в культуру инкубации антибиотика Энроколи выявлено дозозависимое снижение синтеза белка клетками (от 38% при минимальной концентрации до 78% при максимальной концентрации антибиотика).

Применение продуктов жизнедеятельности B.Subtilis в ряде случаев позволяет предотвратить угнетение синтеза белка под влиянием антибиотика, но лишь при его минимальных (0,1 и 1мкг/мл) концентрациях в среде.

Выводы:

1. Впервые на модели эмбриональных клеток курицы показано, что B.Subtilis, являющейся основой препарата Моноспорин, обладает способностью непосредственно влиять на основные синтетические внутриклеточные процессы.

2. Выявленная зависимость «доза — эффект» не является линейной. Во всех случаях малые и средние дозы оказывают стимулирующий эффект, в то время как значительные концентрации продуктов пробиотика оказывают либо ингибирующий (в отношении синтеза ДНК), либо незначительный стимулирующий эффект (синтез РНК и белка).

3. Полученные результаты дают основания предполагать, что среди продуктов жизнедеятельности бактерий, входящих в состав пробиотика Моноспорин, присутствуют вещества, оказывающие угнетающий эффект на анаболические процессы в клетках.

4. Антибиотик ЭНРОКОЛИ оказывает дозозависимый угнетающий эффект на синтетические параметры эмбриональных клеток. Зависимость является линейной. Величина эффекта прямо пропорциональна дозе.

5. Использование продуктов жизнедеятельности B.Subtilis на фоне применения антибиотика ЭНРОКОЛИ в ряде случаев позволяет скорректировать его ингибирующий эффект, при условии минимальной концетрации антибиотика в среде.