Влияние пробиотика «Бацелл-М» на уровень экспрессии генов у бройлеров кросса «Кобб 500» на фоне вакцинации против инфекционного бронхита
Аннотация. В статье представлены результаты изучения экспрессии генов птицы. Исследование выявило максимальное повышение уровня экспрессии генов IL-2, IL-8 и TNF-α у бройлеров, в рацион которых добавляли пробиотик «Бацелл-М» в дозе 50 г на 10 кг корма в течение 30 дней и на 14-е и 28-е сут. жизни привили против инфекционного бронхита кур живой вакциной (штамм «Н-120»), в сравнении с птицей, не получавшей препарат. Это свидетельствует об активизации иммунной системы и увеличении количества продуцируемых в организме генов.По мнению авторов, исследование уровня экспрессии генов может служить методом контроля изменений иммунной системы у сельскохозяйственной птицы.
Ключевые слова: бройлеры, пробиотик «Бацелл-М», вакцинация, экспрессия генов, иммунитет
Для цитирования: Крутов И.О. Влияние пробиотика «Бацелл-М» на уровень экспрессии генов у бройлеров кросса «Кобб 500» на фоне вакцинации против инфекционного бронхита / И.О. Крутов, А.В. Голубцов, Н.А. Стрельников [и др.] // Птица и птицепродукты. 2024. No 3. С. 18–22. Https://doi.org/10.30975/2073-4999-2024-26-3-18-22.
Введение
Изучение иммунного статуса птицы в условиях современного высокоинтенсивного производства является актуальной задачей. Выращивание поголовья сопровождается воздействием различных стресс-факторов, что приводит к снижению резистентности птицы и возрастанию риска возникновения у нее заболеваний различной этиологии.
Инфекционный брoнхит кур (ИБК) — быстропротекающее высококонтагиозное вирусное заболевание, поражающее кур всех возрастов. Возбудитель болезни — вирус семейства коронавирусов (Coronaviridae) с геномом в виде одноцепочечной линейной молекулы РНК. Инфекционную составляющую обеспечивает вирионная РНК, состоящая из нуклеокапсида спиральной симметрии, липопротеидной оболочки и 4 структурных белков. В ходе виропексиса вирус проникает в клетку путем сплавления оболочки вириона с плазматической мембраной клетки. Полный цикл размножения происходит в цитоплазме инфицированных клеток. Дочерние вирионы появляются через 4–6 ч после заражения. Максимально накапливаются вирусы в клетке через 12–36 ч. Вирионная РНК может функционировать как и РНК и обеспечивать синтез вирусоспецифических белков. Вирионы созревают внутри клеток на эндоплазматической мембране и освобождаются почкованием через эндоплазматический ретикулум. Развитие инфекционного процесса сопровождается виремией (проникновением вируса в кровь) с локализацией вирусного антигена в лейкоцитах и эритроцитах до 16 дней после заражения. Вирус находится в почках, селезенке, яичниках, слизистой клоакии даже в фекалиях.
Рис.1. Репродукция коронавирусов
Одним из элементов противодействия распространению вируса являются Toll-подобные рецепторы (TLR). Они относятся к системе врожденного иммунного ответа и обеспечивают распознавание «своих» и «чужих». Различают 11 типов TLR, которые способны распознавать определенные паттерны молекул антигенов бактерий и связывать их. Например, TLR-4 является главным сигнальным рецептором для липополисахаридов грамотрицательных бактерий, термических шоковых протеинов и фибронектина; TLR-1, 2, 6 — для липопротеинов и пептидогликанов грамположительных бактерий, липотейхоевых кислот; TLR-3, 7, 9 — для вирусной РНК, а TLR-5 распознает флагеллины энтероинвазивных бактерий, которые уже проникли внутрь эпителия. Активация этих рецепторов вызывает протеолиз ингибитора IkB — фактора транскрипции NFkB, который перемещается в ядро и запускает гены-мишени, кодирующие синтез провоспалительных цитокинов.
В бурсе развиваются компетентные В-клетки, в тимусе — Т-клетки; их количество увеличивается при воспалительных процессах и при иммунной реакции на антигены. Происходящие при этом изменения могут сопровождаться усилением или ослаблением экспрессии ряда генов, запускающих процесс синтеза провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.
Пищеварительная система также служит защитным барьером от воздействия пестицидов и патогенов. Лимфоидные ткани в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) птиц хорошо развиты и участвуют в активации иммунных реакций. При этом микрофлора, продуцируемая кишечником, непосредственно влияет на экспрессию генов животных и птицы.
В настоящее время в птицеводстве большое значение придают использованию в рационах птицы биологически активных кормовых добавок и препаратов, таких как «Бацелл-М», в состав которого входит «коктейль» из полезной микрофлоры: Bacillus subtilis, Lactobacillus paracasei, Enterococcus faecium и их метаболитов. Такой пробиотический комплекс положительно влияет на ЖКТ, обмен веществ и продуктивность птицы, а также регулирует экспрессию генов, обеспечивая устойчивость иммунитета.
Изучение уровней экспрессии генов позволяет установить иммунный ответ при инфицировании птицы бактериями и вирусами, оценить иммуногенность и реактогенность вакцинных препаратов, отследить формирование специфического клеточно опосредованного ответа.
Интерлейкин-2 (IL-2) представляет собой разновидность фактора роста Т-клеток. Он стимулирует реактивность многих видов клеток, таких как Т-лимфоциты, а также способствует пролиферации, дифференцировке и секреции В-клетками иммуноглобулина (Ig) [10]. Кроме того, IL-2 может стимулировать экспрессию антигена типа MHC II, рецептора трансферрина и инсулина и генерировать множество цитокинов, включая интерферон-γ (IFN-γ), интерлейкины 4, 5 и 6, TNF-α, TNF-β, CSF и т.д.
Провоспалительный хемокин IL-8 является хемоаттрактантом, привлекающим гетерофилы к месту инфекции и вызывающим быструю местную воспалительную реакцию. Он известен своей активностью в отношении гетерофилов и макрофагов у кур. А активация макрофагов стимулирует секрецию важнейшего противовоспалительного цитокина IL-10, который поддерживает баланс иммунной системы путем подавления чрезмерного производства провоспалительных цитокинов.
TNF-α представляет собой плейотропный цитокин, необходимый для контроля внутриклеточных бактерий, таких как Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis и Salmonell atyphimurium. Известно, что он является важным эндогенным медиатором острых и хронических воспалительных реакций.
Исходя из изложенного можно утверждать, что изучение экспрессии генов у птицы является актуальной задачей.
Цель исследований заключалась в определении влияния пробиотика «Бацелл-М» на уровень экспрессии генов у цыплят-бройлеров кросса «Кобб 500» на фоне вакцинации против инфекционного бронхита кур.
Материалы и методы исследований
Исследования проводили на базе лаборатории инновационных препаратов рекомбинантной протеомики отдела экспериментальной фармакологии и моделирования живых систем ФГБНУ ВНИВИПФиТ. Полевые исследования и отбор материала осуществляли на базе ИП «Крутова М.В.» в Липецкой области на бройлерах кросса «Кобб 500». Для эксперимента отобрали 40 цыплят в возрасте 10 дней и по принципу аналогов разделили их на 4 группы, по 10гол. в каждой.
Все бройлеры получали принятый в хозяйстве основной рацион (ОР), в состав которого входил комбикорм BEST. Птицы в группах 1 и 3 дополнительно к ОР в течение 30 дней получали пробиотик «Бацелл-М» в дозе 50г на 10кг корма (табл.1).
Цыплят в группах 1 и 2 на 14-е и 28-е сут. жизни привили против ИБК живой вакциной (штамм «Н-120») ФГБУ ВНИИЗЖ согласно наставлению. Птицу в группах 3 и 4 не вакцинировали. Бройлеры в группе 4 служили контролем.
Таблица 1 - Cхема опыта (n = 40)
| Группа | Особенности рациона | Вакцинация |
|---|---|---|
| 1 | ОР + с 10-го дня жизни пробиотик «Бацелл-М» в дозе 50 г на 10 кг корма в течение 30 дней | На 14-е и 28-е сут. жизни привиты против ИБК живой вакциной (штамм «Н-120») |
| 2 | ОР | На 14-е и 28-е сут. жизни привиты против ИБК живой вакциной (штамм «Н-120») |
| 3 | ОР + с 10-го дня жизни пробиотик «Бацелл-М» в дозе 50 г на 10 кг корма в течение 30 дней | - |
| 4(к) | ОР | - |
В возрасте 42 дней у цыплят осуществили забор крови из подкрыльцовой вены. С целью изучения проб использовали панель специфичных праймеров для оценки экспрессии генов, ответственных за иммунитет (IL-2, IL-8, TNF). Исследование проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе DTlite 4S1 (ДНК-технология, Россия) с готовой смесью для PCR5Х qPCRmix-HS LowROX («Евроген», Россия). Выделение РНК осуществляли, применяя набор «РНК-Экстран» («Синтол», Росси я), по утвержденной инструкции. Качество выделенной РНК оценивали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Исследование проводили посредством ПЦР-анализа с добавлением красителя SYBR Green. Для определения экспрессии изучаемых генов использовали панель специфичных праймеров генов иммунного статуса (табл.2).
Таблица 2 - Список праймеров для ПЦР в реальном времени
| Исследуемый ген | Последовательность праймеров |
|---|---|
| IL-2 | F: GATCTTTGGCTGTATTTCGG R: TCCTGGGTCTCAGTTGGTGTGT |
| IL-8 | F: ATGAACGGCAAGCTTGGAGCT R: GCAGCTCATTCCCCATCTT |
| TNF-α | F: AATTTGCAGGCTGTTTCTGC R: TATGAAGGTGGTGCAGATGG |
Статистическую обработк у осуществляли в Microsoft Excel. Достоверность различий устанавливали по t-критерию Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
На рисунке 2 представлена диаграмма, отражающая уровень экспрессии гена IL-2, регулирующего пролиферацию и дифференцировку эффекторных Т-клеток, макрофагов и естественных клеток-киллеров. Наибольшей экспрессией генов отличалась группа 1, где применяли вакцину против ИБК совместно с пробиотиком «Бацелл-М». Она была в 3,1 раза (р≤0,001) выше, чем в группе 2 с вакциной против ИБК, в 9,3 раза больше, чем в группе 3 с пробиотиком «Бацелл-М», и в 12,2 раза выше, чем в контрольной группе 4.
Применение пробиотика на фоне вакцинации способствует распознаванию вирусных и бактериальных структур TLR/RLRs рецепторами на поверхности мембраны клеток, которые, в свою очередь, активируют внутриклеточный «каскад событий» для дифференцировки Th1- или Th2-клеток, инициирующих гуморальные иммунные реакции.
На рисунке 3 представлена диаграмма, отражающая уровень экспрессии гена IL-8. Наибольший показатель отмечен в группе 1, и он в 8,4 раза выше, чем в группе 2. При этом в группах 3 и 4 экспрессия почти не наблюдалась.
Примечание. Здесь и далее:* при р≤0,5;** при р≤0,05;*** при р≤0,001 относительно группы 4 (к).
Рис. 2. Экспрессия гена цитокина IL-2 у птиц
Рис. 3. Экспрессия гена цитокина IL-8 у птиц
Рис. 4. Экспрессия гена цитокина TNF-α у птиц
Хемотаксический цитокин IL-8 стимулирует резистентность иммунных клеток и способен эффективно рекрутировать Т-хелперы CD4+ клетки, макрофаги и моноциты, индуцировать выработку интерферона-γ. Применение пробиотика на фоне вакцинации повысило естественную резистентность птиц, что подтвердил высокий уровень экспрессии IL-8 в группе 1 по сравнению с остальными группами.
На рисунке 4 представлена диаграмма экспрессии гена — фактора некроза опухоли: TNF-α. Максимальным показателем характеризовалась группа 1, где применяли вакцину против ИБК вместе с пробиотиком «Бацелл-М». Он был на 22% выше, чем у птиц в группе 2, в 2,8 раза больше, чем в группе 3, и в 8,6 раза выше, чем в группе 4 (к).
Фактор некроза опухоли представляет собой плейотропный цитокин, необходимый для контроля внутриклеточных бактерий и участвующий в начальных стадиях воспалительных процессов. Его источником являются макрофаги, стимулируемые лигандами Toll-like рецепторов (TLR). На фоне вакцинации и применения пробиотика «Бацелл-М» (группа 1) происходит активация макрофагов, что приводит к стимуляции неспецифического клеточного иммунитета.
В исследованиях Д.Г. Тюриной с соавторами показано, что исполь- зование антибиотиков на фоне присутствия в кормах остаточных количеств пестицидов снижает эффект от применения антибактериальных препаратов в промышленном птицеводстве. Происходящие при этом изменения могут сопровождаться модификацией экспрессии ряда генов. По нашему мнению, повышение уровня IL-2, IL-8 и TNF-α у бройле- ров при использовании живой вакцины может также способствовать модификации экспрессии генов. Все три исследуемых гена являются провоспалительными цитокинами, участвующими в единой системе иммунного ответа.
Слизистая оболочка ЖКТ обладает собственной лимфоидной тканью (gut-associated lymphoid tissue; GALT), функционально связанной с локализованными в ней антигенпрезентующими клетка ми, преимущественно дендритными, макрофагами и эпителиальными клетками кишечника. В слизистых оболочках находятся Т- и В-лимфоциты, а также клетки врожденного иммунитета: эозинофилы, базофилы, эпите лиальные клетки. Преобладают Т-лимфоциты, среди которых численно доминируют γδТ-лимфоциты, способствующие активации и дифференцировке αβТ-лимфоцитов и развитию адаптивного иммунного ответа.
Очевидно, что разные штаммы пробиотиков по-разному воспринимаются GALT-системой. Тем не менее большинство проведенных исследований свидетельствуют о том, что пробиотические штаммы лактобактерий распознаются TLR и усиливают образование хелперов Tх1, которые синтезируют цитокины, стимулирующие индукцию адаптивного иммунного ответа. Пробиотики, в состав которых входят симбионтные штаммы бактерий, аэробы и анаэробы, вероятно, могут оказывать более многоплановое и мощное иммуномодулирующее влияние, чем монокомпонентные препараты. Такое действие пробиотиков открывает широкие перспективы для их использования в разных направлениях.
Заключение
Проведенные на бройлерах кросса «Кобб 500» исследования выявили повышенный уровень экспрессии генов IL-2, IL-8 и TNF-α в группе 1 в сравнении с другими группами. Это позволяет сделать вывод о том, что использование в рационе птицы пробиотика «Бацелл-М» на фоне иммунизации живой вакциной (штамм «Н-120») способствует активизации макрофагов и Т-клеток и стимуляции как гуморального иммунитета, так и клеточного.
По нашему мнению, определение уровня экспрессии генов может служить методом контроля состояния иммунной системы у сельскохозяйственной птицы.