Влияние пробиотика «Бацелл-М» на уровень экспрессии генов у бройлеров кросса «Кобб 500» на фоне вакцинации против инфекционного бронхита ООО "Биотехагро"
РАЗРАБОТКА И ПРОИЗВОДСТВО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И РАСТЕНИЙ
  • ПРИМЕНЕНИЕ

Влияние пробиотика «Бацелл-М» на уровень экспрессии генов генов у бройлеров кросса «Кобб 500» на фоне вакцинации против инфекционного бронхита

Илья Олегович Крутов1, Андрей Васильевич Голубцов2, Николай Алексеевич Стрельников3, Оксана Михайловна Мармурова4, Татьяна Анатольевна Ерина5, Евгений Владимирович Михайлов6, Надежда Валерьевна Пасько7

1, 2, 3, 6 ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» (ФГБНУ ВНИВИПФиТ), г. Воронеж, Россия
2, 4, 6 ФГБОУ ВО «Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I» (ФГБОУ ВО «ВГАУ имени императора Петра I»), г. Воронеж, Россия
5 ООО «Кормовые Технологии» г. Воронеж, Россия
1 Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Аннотация. В статье представлены результаты изучения экспрессии генов птицы. Исследование выявило максимальное повышение уровня экспрессии генов IL-2, IL-8 и TNF-α у бройлеров, в рацион которых добавляли пробиотик «Бацелл-М» в дозе 50 г на 10 кг корма в течение 30 дней и на 14-е и 28-е сут. жизни привили против инфекционного бронхита кур живой вакциной (штамм «Н-120»), в сравнении с птицей, не получавшей препарат. Это свидетельствует об активизации иммунной системы и увеличении количества продуцируемых в организме генов.По мнению авторов, исследование уровня экспрессии генов может служить методом контроля изменений иммунной системы у сельскохозяйственной птицы.

Ключевые слова: бройлеры, пробиотик «Бацелл-М», вакцинация, экспрессия генов, иммунитет

Для цитирования: Крутов И.О. Влияние пробиотика «Бацелл-М» на уровень экспрессии генов у бройлеров кросса «Кобб 500» на фоне вакцинации против инфекционного бронхита / И.О. Крутов, А.В. Голубцов, Н.А. Стрельников [и др.] // Птица и птицепродукты. 2024. No 3. С. 18–22. Https://doi.org/10.30975/2073-4999-2024-26-3-18-22.

Введение

Изучение иммунного статуса птицы в условиях современного высокоинтенсивного производства является актуальной задачей. Выращивание поголовья сопровождается воздействием различных стресс-факторов, что приводит к снижению резистентности птицы и возрастанию риска возникновения у нее заболеваний различной этиологии.

Инфекционный брoнхит кур (ИБК) — быстропротекающее высококонтагиозное вирусное заболевание, поражающее кур всех возрастов. Возбудитель болезни — вирус семейства коронавирусов (Coronaviridae) с геномом в виде одноцепочечной линейной молекулы РНК. Инфекционную составляющую обеспечивает вирионная РНК, состоящая из нуклеокапсида спиральной симметрии, липопротеидной оболочки и 4 структурных белков. В ходе виропексиса вирус проникает в клетку путем сплавления оболочки вириона с плазматической мембраной клетки. Полный цикл размножения происходит в цитоплазме инфицированных клеток. Дочерние вирионы появляются через 4–6 ч после заражения. Максимально накапливаются вирусы в клетке через 12–36 ч. Вирионная РНК может функционировать как и РНК и обеспечивать синтез вирусоспецифических белков. Вирионы созревают внутри клеток на эндоплазматической мембране и освобождаются почкованием через эндоплазматический ретикулум. Развитие инфекционного процесса сопровождается виремией (проникновением вируса в кровь) с локализацией вирусного антигена в лейкоцитах и эритроцитах до 16 дней после заражения. Вирус находится в почках, селезенке, яичниках, слизистой клоакии даже в фекалиях.

Репродукция коронавирусов

Рис.1. Репродукция коронавирусов

 

Одним из элементов противодействия распространению вируса являются Toll-подобные рецепторы (TLR). Они относятся к системе врожденного иммунного ответа и обеспечивают распознавание «своих» и «чужих». Различают 11 типов TLR, которые способны распознавать определенные паттерны молекул антигенов бактерий и связывать их. Например, TLR-4 является главным сигнальным рецептором для липополисахаридов грамотрицательных бактерий, термических шоковых протеинов и фибронектина; TLR-1, 2, 6 — для липопротеинов и пептидогликанов грамположительных бактерий, липотейхоевых кислот; TLR-3, 7, 9 — для вирусной РНК, а TLR-5 распознает флагеллины энтероинвазивных бактерий, которые уже проникли внутрь эпителия. Активация этих рецепторов вызывает протеолиз ингибитора IkB — фактора транскрипции NFkB, который перемещается в ядро и запускает гены-мишени, кодирующие синтез провоспалительных цитокинов.

В бурсе развиваются компетентные В-клетки, в тимусе — Т-клетки; их количество увеличивается при воспалительных процессах и при иммунной реакции на антигены. Происходящие при этом изменения могут сопровождаться усилением или ослаблением экспрессии ряда генов, запускающих процесс синтеза провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

Пищеварительная система также служит защитным барьером от воздействия пестицидов и патогенов. Лимфоидные ткани в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) птиц хорошо развиты и участвуют в активации иммунных реакций. При этом микрофлора, продуцируемая кишечником, непосредственно влияет на экспрессию генов животных и птицы.

В настоящее время в птицеводстве большое значение придают использованию в рационах птицы биологически активных кормовых добавок и препаратов, таких как «Бацелл-М», в состав которого входит «коктейль» из полезной микрофлоры: Bacillus subtilis, Lactobacillus paracasei, Enterococcus faecium и их метаболитов. Такой пробиотический комплекс положительно влияет на ЖКТ, обмен веществ и продуктивность птицы, а также регулирует экспрессию генов, обеспечивая устойчивость иммунитета.

Изучение уровней экспрессии генов позволяет установить иммунный ответ при инфицировании птицы бактериями и вирусами, оценить иммуногенность и реактогенность вакцинных препаратов, отследить формирование специфического клеточно опосредованного ответа.

Интерлейкин-2 (IL-2) представляет собой разновидность фактора роста Т-клеток. Он стимулирует реактивность многих видов клеток, таких как Т-лимфоциты, а также способствует пролиферации, дифференцировке и секреции В-клетками иммуноглобулина (Ig) [10]. Кроме того, IL-2 может стимулировать экспрессию антигена типа MHC II, рецептора трансферрина и инсулина и генерировать множество цитокинов, включая интерферон-γ (IFN-γ), интерлейкины 4, 5 и 6, TNF-α, TNF-β, CSF и т.д.

Провоспалительный хемокин IL-8 является хемоаттрактантом, привлекающим гетерофилы к месту инфекции и вызывающим быструю местную воспалительную реакцию. Он известен своей активностью в отношении гетерофилов и макрофагов у кур. А активация макрофагов стимулирует секрецию важнейшего противовоспалительного цитокина IL-10, который поддерживает баланс иммунной системы путем подавления чрезмерного производства провоспалительных цитокинов.

Таблица 1 - Cхема опыта (n = 40)

Группа Особенности рациона Вакцинация
1 ОР + с 10-го дня жизни пробиотик «Бацелл-М» в дозе 50 г на 10 кг корма в течение 30 дней ОР + с 10-го дня жизни пробиотик «Бацелл-М» в дозе 50 г на 10 кг корма в течение 30 дней
2 ОР На 14-е и 28-е сут. жизни привиты против ИБК живой вакциной (штамм «Н-120»)
3 ОР + с 10-го дня жизни пробиотик «Бацелл-М» в дозе 50 г на 10 кг корма в течение 30 дней -
4(к) ОР -

TNF-α представляет собой плейотропный цитокин, необходимый для контроля внутриклеточных бактерий, таких как Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis и Salmonell atyphimurium. Известно, что он является важным эндогенным медиатором острых и хронических воспалительных реакций.

Исходя из изложенного можно утверждать, что изучение экспрессии генов у птицы является актуальной задачей.

Цель исследований заключалась в определении влияния пробиотика «Бацелл-М» на уровень экспрессии генов у цыплят-бройлеров кросса «Кобб 500» на фоне вакцинации против инфекционного бронхита кур.

Материалы и методы исследований

Исследования проводили на базе лаборатории инновационных препаратов рекомбинантной протеомики отдела экспериментальной фармакологии и моделирования живых систем ФГБНУ ВНИВИПФиТ. Полевые исследования и отбор материала осуществляли на базе ИП «Крутова М.В.» в Липецкой области на бройлерах кросса «Кобб 500». Для эксперимента отобрали 40 цыплят в возрасте 10 дней и по принципу аналогов разделили их на 4 группы, по 10гол. в каждой.

Все бройлеры получали принятый в хозяйстве основной рацион (ОР), в состав которого входил комбикорм BEST. Птицы в группах 1 и 3 дополнительно к ОР в течение 30 дней получали пробиотик «Бацелл-М» в дозе 50г на 10кг корма (табл.1).

Цыплят в группах 1 и 2 на 14-е и 28-е сут. жизни привили против ИБК живой вакциной (штамм «Н-120») ФГБУ ВНИИЗЖ согласно наставлению. Птицу в группах 3 и 4 не вакцинировали. Бройлеры в группе 4 служили контролем.

В возрасте 42 дней у цыплят осуществили забор крови из подкрыльцовой вены. С целью изучения проб использовали панель специфичных праймеров для оценки экспрессии генов, ответственных за иммунитет (IL-2, IL-8, TNF). Исследование проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе DTlite 4S1 (ДНК-технология, Россия) с готовой смесью для PCR5Х qPCRmix-HS LowROX («Евроген», Россия). Выделение РНК осуществляли, применяя набор «РНК-Экстран» («Синтол», Росси я), по утвержденной инструкции. Качество выделенной РНК оценивали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Исследование проводили посредством ПЦР-анализа с добавлением красителя SYBR Green. Для определения экспрессии изучаемых генов использовали панель специфичных праймеров генов иммунного статуса (табл.2).

Таблица 2 - Список праймеров для ПЦР в реальном времени

Исследуемый ген Последовательность праймеров
IL-2 F: GATCTTTGGCTGTATTTCGG
R: TCCTGGGTCTCAGTTGGTGTGT
IL-8 F: ATGAACGGCAAGCTTGGAGCT
R: GCAGCTCATTCCCCATCTT
TNF-α F: AATTTGCAGGCTGTTTCTGC
R: TATGAAGGTGGTGCAGATGG

Статистическую обработк у осуществляли в Microsoft Excel. Достоверность различий устанавливали по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение

На рисунке 2 представлена диаграмма, отражающая уровень экспрессии гена IL-2, регулирующего пролиферацию и дифференцировку эффекторных Т-клеток, макрофагов и естественных клеток-киллеров. Наибольшей экспрессией генов отличалась группа 1, где применяли вакцину против ИБК совместно с пробиотиком «Бацелл-М». Она была в 3,1 раза (р≤0,001) выше, чем в группе 2 с вакциной против ИБК, в 9,3 раза больше, чем в группе 3 с пробиотиком «Бацелл-М», и в 12,2 раза выше, чем в контрольной группе 4.

Применение пробиотика на фоне вакцинации способствует распознаванию вирусных и бактериальных структур TLR/RLRs рецепторами на поверхности мембраны клеток, которые, в свою очередь, активируют внутриклеточный «каскад событий» для дифференцировки Th1- или Th2-клеток, инициирующих гуморальные иммунные реакции.

На рисунке 3 представлена диаграмма, отражающая уровень экспрессии гена IL-8. Наибольший показатель отмечен в группе 1, и он в 8,4 раза выше, чем в группе 2. При этом в группах 3 и 4 экспрессия почти не наблюдалась.

Уровень экспрессии гена IL-2

Примечание. Здесь и далее:* при р≤0,5;** при р≤0,05;*** при р≤0,001 относительно группы 4 (к).

Рис. 2. Экспрессия гена цитокина IL-2 у птиц

Уровень экспрессии гена IL-8

Рис. 3. Экспрессия гена цитокина IL-8 у птиц

Уровень экспрессии гена TNF-α

Рис. 4. Экспрессия гена цитокина TNF-α у птиц

 

Хемотаксический цитокин IL-8 стимулирует резистентность иммунных клеток и способен эффективно рекрутировать Т-хелперы CD4+ клетки, макрофаги и моноциты, индуцировать выработку интерферона-γ. Применение пробиотика на фоне вакцинации повысило естественную резистентность птиц, что подтвердил высокий уровень экспрессии IL-8 в группе 1 по сравнению с остальными группами.

На рисунке 4 представлена диаграмма экспрессии гена — фактора некроза опухоли: TNF-α. Максимальным показателем характеризовалась группа 1, где применяли вакцину против ИБК вместе с пробиотиком «Бацелл-М». Он был на 22% выше, чем у птиц в группе 2, в 2,8 раза больше, чем в группе 3, и в 8,6 раза выше, чем в группе 4 (к).

Фактор некроза опухоли представляет собой плейотропный цитокин, необходимый для контроля внутриклеточных бактерий и участвующий в начальных стадиях воспалительных процессов. Его источником являются макрофаги, стимулируемые лигандами Toll-like рецепторов (TLR). На фоне вакцинации и применения пробиотика «Бацелл-М» (группа 1) происходит активация макрофагов, что приводит к стимуляции неспецифического клеточного иммунитета.

В исследованиях Д.Г. Тюриной с соавторами показано, что исполь- зование антибиотиков на фоне присутствия в кормах остаточных количеств пестицидов снижает эффект от применения антибактериальных препаратов в промышленном птицеводстве. Происходящие при этом изменения могут сопровождаться модификацией экспрессии ряда генов. По нашему мнению, повышение уровня IL-2, IL-8 и TNF-α у бройле- ров при использовании живой вакцины может также способствовать модификации экспрессии генов. Все три исследуемых гена являются провоспалительными цитокинами, участвующими в единой системе иммунного ответа.

Слизистая оболочка ЖКТ обладает собственной лимфоидной тканью (gut-associated lymphoid tissue; GALT), функционально связанной с локализованными в ней антигенпрезентующими клетка ми, преимущественно дендритными, макрофагами и эпителиальными клетками кишечника. В слизистых оболочках находятся Т- и В-лимфоциты, а также клетки врожденного иммунитета: эозинофилы, базофилы, эпите лиальные клетки. Преобладают Т-лимфоциты, среди которых численно доминируют γδТ-лимфоциты, способствующие активации и дифференцировке αβТ-лимфоцитов и развитию адаптивного иммунного ответа.

Очевидно, что разные штаммы пробиотиков по-разному воспринимаются GALT-системой. Тем не менее большинство проведенных исследований свидетельствуют о том, что пробиотические штаммы лактобактерий распознаются TLR и усиливают образование хелперов Tх1, которые синтезируют цитокины, стимулирующие индукцию адаптивного иммунного ответа. Пробиотики, в состав которых входят симбионтные штаммы бактерий, аэробы и анаэробы, вероятно, могут оказывать более многоплановое и мощное иммуномодулирующее влияние, чем монокомпонентные препараты. Такое действие пробиотиков открывает широкие перспективы для их использования в разных направлениях.

Заключение

Проведенные на бройлерах кросса «Кобб 500» исследования выявили повышенный уровень экспрессии генов IL-2, IL-8 и TNF-α в группе 1 в сравнении с другими группами. Это позволяет сделать вывод о том, что использование в рационе птицы пробиотика «Бацелл-М» на фоне иммунизации живой вакциной (штамм «Н-120») способствует активизации макрофагов и Т-клеток и стимуляции как гуморального иммунитета, так и клеточного.

По нашему мнению, определение уровня экспрессии генов может служить методом контроля состояния иммунной системы у сельскохозяйственной птицы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Птица и птицепродукты, №3 2004г.

Скачать статью

Наверх