РАЗРАБОТКА И ПРОИЗВОДСТВО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И РАСТЕНИЙ
  • ПРИМЕНЕНИЕ
See this article in English here

 

 

Эффективность применения препаратов «Моноспорин» и «Бацелл» при микотоксикозах птицы

Труфанов О.В., Котик А.Н., Труфанова В.А., Институт птицеводства УААН;
Бойко Н.В., Ужгородский национальный университет

Резюме. Потребление цыплятами корма, содержащего Т-2 токсин в концентрации 10 мг/кг, вызывало снижение среднесуточного привеса на 31%, увеличение относительной массы сердца, поджелудочной железы и почек, уменьшение относительной массы органов кроветворения - селезенки и бурсы, а также снижение концентрации общего белка и креатинина в плазме крови. Наличие в корме для цыплят НТ-2 токсина в концентрации 16 мг/кг привело к снижению среднесуточного привеса на 14%, а также оказало негативное воздействие на состояние почек, которое выражалось в увеличении их относительной массы и повышении концентрации мочевой кислоты и креатинина в плазме крови. Пробиотический препарат «Моноспорин» на основе штамма Bacillus subtilis оказывал положительное действие на величину среднесуточного привеса, относительную массу сердца, почек и концентрацию общего белка в плазме крови при Т-2 и НТ-2 токсикозах цыплят. Совместное применение пробиотического препарата «Моноспорин» и ферментно-пробиотического препарата «Бацелл» при Т-2 и НТ-2 токсикозах цыплят нормализовало значения живого веса, относительной массы сердца и содержания креатинина в плазме крови.

Введение. Т-2 и НТ-2 токсикозы птицы возникают вследствие хронического воздействия трихотеценовых микотоксинов, содержащихся в недоброкачественных кормах. По данным анализов, проводимых в лаборатории микотокмикологии Института птицеводства УААН, около 20% зерна и комбикормов загрязнены Т-2 и НТ-2 токсинами [Труфанов О. В., 2005; Котик А. Н и др., 2006]. К признакам Т-2 токсикоза относятся некротический стоматит, снижение прироста живой массы, увеличение падежа, снижение мясной и яичной продуктивности [Wyatt R. D. et al., 1975], подавление биосинтеза белка [Middlbrook J.L.et al., 1989], иммуносупрессия [Taylor M.J.et al., 1989].

Наиболее эффективным средством профилактики микотокскозов является предотвращение загрязнения зерна микотоксинами на всех этапах его выращивания и хранения [Котик А. М. та ін., 2007]. Если все же контаминация зерна произошла и не удается избежать его использования в качестве корма для птицы, то необходимо применять препараты, снижающие интенсивность вредного воздействия микотоксинов. К таким препаратам относят сорбенты [Avantaggiato G., 2005] и пробиотические препараты [Paškevicius A., 2006]. Действие сорбентов основано на связывании токсинов в кишечном тракте и выведении их из организма [Dakovic A., 2005]. Хотя некоторые сорбенты достаточно эффективно связывают и удерживают отдельные микотоксины, все они обладают негативным побочным действием:

1) сорбция полезных для организма веществ - витаминов, незаменимых аминокислот, полиненасыщенных жирных кислот, лекарственных препаратов, а также полезных микроорганизмов;

2) механическое повреждение эпителия слизистой оболочки кишечника, вследствие чего патогенная микрофлора может проникнуть в организм;

3) высокая гигроскопичность.

Ввиду перечисленных выше недостатков кормовых адсорбентов их применение должно быть ограничено лишь теми случаями, когда наличие микотоксинов в кормах доказано. При этом нужно учитывать природу микотоксинов и их концентрацию, а также повысить норму ввода в корм тех веществ, которые могут быть связаны сорбентами.

Действие пробиотических препаратов основано на способности микроорганизмов вырабатывать ферменты, разрушающие микотоксины [Труфанов О.В., 2007]. В последние годы обнаружены микроорганизмы, синтезирующие карбоксилэстеразы и эпоксидгидролазы [Binder E.-M. et al., 2004], трансфармирующие трихотеценовые микотоксины, лактонгдролазу (разрушает зеараленон) [Takahashi-Ando N. et al., 2004], фумонизин гидролазу [Duvick J. et al., 1998], УДФ-гликозилтрансферазы, снижающие токсичность дезоксиниваленола [Poppenberger B. et al., 2006] и прочие. Кроме того, пробиотические микроорганизмы продуцируют целый ряд биологически активных веществ, которые повышают устойчивость организма птицы к негативному действию микотоксинов. К таким веществам относятся:

1) вещества, подавляющие развитие патогенных бактерий - органические кислоты и природные антибиотики;

2) факторы, повышающие биодоступность питательных веществ - гидролитические ферменты и поверхностно-активные вещества;

3) незаменимые компоненты рациона - витамины и аминокислоты.

Одним из наиболее привлекательных микроорганизмов для создания пробиотических препаратов является Bacillus subtilis. Бактериям этого вида присуща способность продуцировать все перечисленные выше биологически активные вещества [Priest F.G., 1977; Ramos H.C., 2000; Stein T., 2005].

Созданный на основе бактерий штамма B.subtilis препарат «Моноспорин» с успехом применяют для лечения и профилактики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, получения привесов и повышения питательной ценности кормов [Бойко Н. В. и др., 2006]. Кроме того, бактерии штаммов B.Subtilis, входящие в состав препаратов «Моноспорин» и «Бацелл», в несколько раз повышают интенсивность роста целлюлозолитических руминококков и лактобацилл.

Целью данной работы было изучение лечебно-профилактического эффекта выпаивания цыплят пробиотическим препаратом «Моноспорин» и включения в корм ферментно-пробиотического препарата «Бацелл» на протекание хронического Т-2 токсикоза и НТ-2 токсикоза.

Материалы и методы. В работе использовали цыплят породы полтавская глинистая. Птицу содержали в клетках в стандартных условиях по 10 голов в секции. Было сформировано 7 групп по 10 голов в группе (табл. 1). Первая группа - контрольная. В корм 2-4 групп вносили Т-2 токсин, 5-7 - НТ-2 токсин в концентрациях 10 и 16 мг/кг, соответственно. Цыплят третьей, четвертой, шестой и седьмой групп выпаивали пробиотическим препаратом «Моноспорин» с уровнем дозы 3мл на 100 голов в сутки. В корм четвертой и седьмой групп включали ферментно-пробиотический препарат «Бацелл» в количестве 2г на кг корма. Кормили кормовым концентратом для молодняка птицы в возрасте 5-30 дней КК 2-6 в соответствии с рекомендуемыми нормами, воду давали ad libitum после выпойки препаратом.

Таблица 1 - Схема опыта

Группа Т-2 токсин НТ-2 токсин «Моноспорин» «Моноспорин» + «Бацелл»
1 - - - -
2 + - - -
3 + - + -
4 + - + +
5 - + - -
6 - + + -
7 - + + +

Препараты «Моноспорин» и «Бацелл» были любезно предоставлены Карганяном А.К. (ООО СХП «Нива»).

Т-2 токсин получали методом адсорбционной колоночной хроматографии по ранее описанному методу из экстракта культуры на зерне штамма Fusarium sporotrichioides 2m-15-206 [Котик А. Н и др., 1979]. НТ-2 токсин получали путем щелочного гидролиза Т-2 токсина. НТ-2 токсин экстрагировали из реакционной смеси хлороформом и очищали методом распределительной колоночной хроматографии.

Опыт проводили в течение 31 дня, начиная с суточного возраста. Цыплят взвешивали в 1, 8, 16, 24 и 31 день. В течение опытного периода регистрировали появление некротического стоматита. В конце опыта цыплят усыпляли диэтиловым эфиром, декапитировали и проводили отбор крови. В плазме крови определяли концентрацию мочевой кислоты по реакции с фосфорно-вольфрамовым реактивом, креатинина методом Яффе-Поппера и общего белка по биуретовой реакции с использованием наборов реактивов «Реагент» в соответствии с инструкциями. Тушки вскрывали, регистрировали патолого-анатомические изменения, фотографировали и утилизировали в чешской яме. Внутренние органы взвешивали и рассчитывали относительную массу.

Статистическую обработку полученных данных проводили методом множественных сравнений Шеффе и путем нахождения критерия ранговых сумм Фридмана [Лапач С.Н. и др., 2001]; группы 1-3 с группами 4-6 не сравнивали.

Результаты. Результаты проведенного опыта представлены на рисунках 1, 2, 3 и в таблицах 2 и 3.

Токсическое действие микотоксинов. У цыплят, которые получали Т-2 токсин, наблюдалось уменьшение живого веса (рис.1), снижение среднесуточного привеса на 31% (рис.3), увеличение относительной массы сердца на 16, поджелудочной железы на 27 и почек на 52%, уменьшение относительной массы селезенки на 62 и бурсы на 31% (табл.2), снижение концентрации общего белка на 39 и креатинина в плазме крови на 17% (табл.3). Цыплята, в корм которых был включен НТ-2 токсин, отставали в росте (среднесуточный привес был ниже на 14%, рис.3), отличались относительно небольшим живым весом, повышенной в 1,5 раза относительной массой почек, низкой относительной массой селезенки (ниже на 30%) и повышенным содержанием мочевой кислоты и креатинина в плазме крови (на 108 и 10%, соответственно).

Профилактическое действие «Моноспорина». В результате выпаивания цыплят препаратом «Моноспорин» на фоне Т-2 токсикоза наблюдалась нормализация живого веса - на 16 и 24 день опыта статистически значимых отличий с аналогичным показателем контрольной группы не обнаружили. Относительная масса сердца и почек была на, соответственно, 9 и 21% ниже, чем в группе, получавшей только Т-2 токсин.

У цыплят, которых выпаивали «Моноспорином» на фоне НТ-2 токсикоза средний прирост живого веса не отличался от контрольного показателя. Относительная масса почек у цыплят, получавших НТ-2 токсин и «Моноспорин», была на 21% ниже, а концентрация общего белка в плазме крови на 23% выше, чем у цыплят, получавших только НТ-2 токсин.

Динамика изменения живого веса цыплят

Рисунок 1. Динамика изменения живого веса цыплят.

Примечание: цифры над столбцами указывают на номера групп, отличия относительно которых статистически значимы (p<0,05).

Сравнение средних привесов различных групп цыплят

Рисунок 2. Сравнение средних привесов различных групп цыплят.

Примечание: цифры над столбцами указывают на номера групп, отличия относительно которых статистически значимы (p<0,05).

Среднесуточные привесы различных групп цыплят

Рисунок 3. Среднесуточные привесы различных групп цыплят.

Примечание: цифры над столбцами указывают на номера групп, отличия относительно которых статистически значимы (p<0,05).

Таблица 2 - Влияние препаратов «Моноспорин» и «Бацелл» на относительные массы внутренних органов (мг%) цыплят при Т-2 и НТ-2 токсикозах

Группа Сердце Печень Поджелудочная железа Почки Селезенка Бурса
1 661±16 (2, 7) 2935±55 (3) 386±24
(2, 3)
930±38
(2, 4, 5, 7)
268±27
(2, 3, 4, 5)
554±51
(2, 3, 4, 7)
2 768±53 (1, 3, 4) 3289±180 491±27
(1)
1412±111 (1, 3) 102±11 (1) 382±37 (1)
3 698±68 (2) 3728±191 (1, 4) 502±31
(1)
1119±125 (2) 122±18 (1) 361±47
(1)
4 658±24 (2) 3012±84 (3) 458±27 1204±41 (1) 109±15 (1) 389±29
(1)
5 695±40 (7) 3340±230 434±26 1390±62
(1, 6)
188±35 (1) 482±32
6 693±27 (7) 3177±95 431±27 1105±49 (5) 178±14 492±34 (7)
7 604±13 (1, 5, 6) 3330±131 390±17 1212±42 (1) 188±15 363±20 (1, 6)

Примечание: цифры в скобках указывают на номера групп, отличия относительно которых статистически значимы (p<0,05).

Таблица 3 - Влияние препаратов «Моноспорин» и «Бацелл» на диагностические показатели биохимического состава крови цыплят при Т-2 и НТ-2 токсикозах

Группа Гемоглобин,
г/л
Общий белок,
г/л
Мочевая кислота,
ммоль/л
Креатинин,
мкмоль/л
1 141±12 (4, 6) 40,1±3,7 (2, 3, 4) 0,12±0,04 (4, 5, 6) 27,4±1,8 (2, 4, 5)
2 107±13 28,8±3,5 (1) 0,10±0,02 (3, 4) 23,4±2,1 (1)
3 108±12 27,3±2,7 (1) 0,18±0,04 (2) 25,5±1,2
4 90±9 (1) 28,7±3,1 (1) 0,20±0,04 (1, 2) 23,3±1,6 (1)
5 109±7 34,0±4,9 (6) 0,25±0,06 (1) 30,0±1,6 (1)
6 88±11 (1) 44,0±3,8 (5, 7) 0,23±0,04 (1) 30,0±1,7
7 112±12 32,1±2,4 (1, 6) 0,22±0,02 28,4±1,7

Примечание: цифры в скобках указывают на номера групп, отличия относительно которых статистически значимы (p<0,05).

Эффект одновременного применения «Моноспорина» и «Бацелла» при микотоксикозах. Применение сразу двух препаратов на фоне Т-2 токсикоза цыплят привело к увеличению живого веса на 31 день опыта на 13% относительно группы, получавшей только Т-2 токсин. Живой вес цыплят, получавших оба препарата при НТ-2 токсикозе, не отличался от значения этого показателя в контрольной группе на 16, 24 и 31 день. Средние привесы 4-й и 7-й групп за период с 24-го по 31-й день эксперимента не отличались от среднего привеса контрольной группы. Следует отметить нормализацию относительной массы сердца и содержания креатинина в плазме крови при комплексном применении препаратов.

Обсуждение. Как известно, механизм токсического действия трихотеценовых микотоксинов заключается в ингибировании синтеза белка на всех стадиях этого процесса [Cundliffe E. et al., 1974, 1977]. Одна молекула Т-2 токсина или НТ-2 токсина способна полностью «выключить» целую белоксинтезирующую фабрику клетки - рибосому [Middlbrook J.L. et al., 1989]. Данные о содержании общего белка в плазме крови являются подтверждением этому. На уровне организма птицы токсическое действие Т-2 и НТ-2 токсинов проявляется также в снижении скорости роста, снижении функциональной активности внутренних органов и подавлении иммунной системы.

Одной из причин повышения концентрации креатинина и мочевой кислоты в крови может быть недостаточная функциональная активность почек, о чем также свидетельствует компенсаторное увеличение их относительной массы. Следует отметить, что в результате воздействия НТ-2 токсина негативный эффект на почках выражен в большей степени, чем при воздействии Т-2 токсина. Причина этого различия, вероятно, кроется в более высокой растворимости НТ-2 токсина в воде, вследствие чего он не депонируется в тканях и органах с относительно высоким содержанием липидов, в т. ч. печени, где протекают реакции биотрансформации ксенобиотиков. В неизмененном виде НТ-2 токсин попадает в почки, где и оказывает токсическое действие, после чего элиминируется из организма посредством фильтрации.

На чем же основано профилактическое действие пробиотических препаратов «Моноспорин» и «Бацелл» при Т-2 и НТ-2 токсикозах? Секрет заключается в том, что бактерии Bacillus subtilis, входящие в состав препаратов, обладают уникальным семейством ферментов - α/β-гидролаз - активируемых при стрессе [Brody M.S. et al., 2001]. Эти ферменты характеризуются широким спектром каталитической активности, т.е. способны метаболизировать самые разнообразные соединения. Стрессовыми факторами, запускающими механизм синтеза этих ферментов, могут быть практические любые отклонения нормальных параметров среды обитания B.Subtilis [Petersohn A. et al., 2001]. Например, в кишечнике цыпленка синтез α/β-гидролаз активируется относительно высокой температурой (42 °С) и колебаниями кислотности. На рис.4 показано, что эти факторы запускают синтез карбоксилэстеразы, которая катализирует гидролиз сложноэфирных групп Т-2 токсина, превращая его в гораздо менее токсичный метаболит - Т-2 тетраол, и эпоксидгидролазы, разрушающей наиболее токсигенную группу - эпоксидную - в результате чего образуется практически безвредный деэпокси Т-2 тетраол. Это соединение, во-первых, характеризуется высокой гидрофильностью, и, следовательно, не депонируется в тканях и быстро выводится из организма, и, во-вторых, не взаимодействует с рибосомами, т. е. не подавляет синтез белка [Binder E.-M. et al., 2004]. Таким образом, карбоксилэстеразы и эпоксидгидролазы, синтезируемые B. subtilis, осуществляют детоксикацию Т-2 и НТ-2 токсинов, воздействуя на различные химические группы молекул микотоксинов.

Механизм биотрансформации Т-2 токсина ферментами B.subtilis

Рис. 4. Механизм биотрансформации Т-2 токсина ферментами B.subtilis

Выводы

1. Потребление цыплятами корма, содержащего Т-2 токсин в концентрации 10мг/кг, вызывает снижение среднесуточного привеса на 31%, увеличение относительной массы сердца, поджелудочной железы и почек, уменьшение относительной массы органов кроветворения - селезенки и бурсы, а также снижение концентрации общего белка и креатинина в сыворотке крови.

2. Наличие в корме для цыплят НТ-2 токсина в концентрации 16мг/кг приводит к снижению среднесуточного привеса на 14%, а также оказывает негативное воздействие на состояние почек, которое выражаться в увеличении их относительной массы и повышении концентрации мочевой кислоты и креатинина в плазме крови.

3. Пробиотический препарат «Моноспорин» оказывает положительное действие на величину среднесуточного привеса, относительную массу сердца, почек и концентрацию общего белка в плазме крови при Т-2 и НТ-2 токсикозах цыплят.

4. Совместное применение пробиотического препарата «Моноспорин» и ферментно-пробиотического препарата «Бацелл» при Т-2 и НТ-2 токсикозах цыплят нормализует значения живого веса, относительной массы сердца и содержания креатинина в плазме крови.

Литература

1. Бойко Н.В., Карганян А.К., Петенко А.И. Биотехнологические решения - безопасность и продуктивность птицы // Птахівництво: Міжвід. темат. наук. зб./ ІП УААН. - Харків, 2006. - Вип.58. - С.202-207.

2. Котик А.М., Труфанова В.О., Труфанов О.В. Частота обнаружения Т-2 токсина, НТ-2 токсина, дезоксиниволенола, зеараленона и фумонизинов в различных кормовых субстратах // Птахівництво: Міжвід. темат. наук. зб./ ІП УААН. - Харків, 2006. - Вип.58. - С.556-562.

3. Котик А.М., Труфанов О.В. Корми: корисні, якісні, безпечні. // Эксклюзив агро. - 2007. - №1. - С.46-49.

4. Котик А. Н., Чернобай В. Т., Комисаренко Н. Ф., Труфанова В. А. Выделение микоток¬сина Fusarium sporotrichiella и изучение его физико-химических свойств // Микробиол. журнал - 1979. - 41. Вып. 6. - С. 636-639.

5. Лапач С. Н., Чубенко А. В., Бабич П. Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel. - 2-е изд. - К.: Морион, - 2001. - 408 с.

6. Труфанов О. В. НТ-2 токсин - распространенный фактор загрязнения зерна в Украине // Птахівництво: Міжвід. темат. наук. зб./ ІП УААН. - Харків, 2005. - Вип. 57. - С. 450-454.

7. Труфанов О. В. Современные методы обеззараживания зерна и комбикормов, контаминированных микотоксинами // Ефективні корми та годівля. - 2007. - № 4. - 17-21.

8. Avantaggiato G., Solfrizzo M., Visconti A. Recent advances on the use of adsorbent materials for detoxification of Fusarium mycotoxins // Food Addit Contam. 2005 Apr; 22 (4):379-88.

9. Binder E.-M., Binder J. Strain of eubacterium that detoxifies trichothecenes // U.S. Patent No. 6794175 B1, 2004.

10. Brody M. S., Vijay K., Price C. W. Catalytic function of an α/β hydrolase is required for energy stress activation of the σB transcription factor in bacillus subtilis // Journal of bacteriology - 2001. - Vol. 183. - No. 21. - P. 6422-6428.

11. Cundliffe E., Cannon M., Davis J. Mechanism of inhibition of eukaryotic protein synthesis by trichothecene fungal toxins // Proc. NW. Acad. Sci. USA. Vol. 71, No. 1, pp. 30-34, 1974.

12. Cundliffe E., Davis J. Inhibition of Initiation, Elongation, and Termination of Eukaryotic Protein Synthesis by Trichothecene Fungal Toxins // Antimicrobial agents and chemotherapy, Mar. 1977, p. 491-499 Vol. 11, No. 3.

13. Dakovic A., Tomasevic-Canovic M., Dondur V., Rottinghaus G. E., Medakovic V., Zaric S. Adsorption of mycotoxins by organozeolites. // Colloids Surf B Biointerfaces. 2005 Nov 25;46(1):20-5. Epub 2005 Sep 28.

14. Duvick J., Rood T., Wang X. Fumonisin detoxification enzymes // U.S. Patent No. 5716820, 1998.

15. Middlbrook, J.L., and D.L. Leatherman. Binding to T-2 toxin to eukaryotic cell ribosomes // Biochem. Pharmacol. 1989. 383103.

16. Paškevicius A., Bakutis B., Baliukoniene V., Šakalyte J. The search for ecologically safe means of mycotoxin detoxification in fodder // Ekologija. 2006. Nr.3. P.128-131.

17. Petersohn A., Brigulla M., Haas S., Hoheisel J.D., Volker U., Hecker M. Global Analysis of the General Stress Response of Bacillus subtilis // Journal of bacteriology. - 2001. - Vol.183. - No.19. - p.5617-5631.

18. Poppenberger B., Adam G., Berthiller F., Krska R., Kuchler K., Luschler C., Glossl J. et al. Method for detoxification of mycotoxins // U.S. Patent No. 0183202 A1, 2006.

19. Priest F.G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus // Bacteriol Rev. 1977 September; 41(3): 711-753.

20. Ramos H. C., Hoffmann T., Marino M., Nedjari H., Presecan-Siedel E., Dreesen O., Glaser P., Jahn D. Fermentative Metabolism of Bacillus subtilis: Physiology and Regulation of Gene Expression // J. Bacteriol. 2000 June; 182(11):3072-3080.

21. Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions // Molecular microbiology - 2005. Vol.56. - No.4. - P. 845-857.

22. Takahashi-Ando N., Ohsato S., Shibata T., Hamamoto H., Yamaguchi I., Kimura M. Metabolism of Zearalenone by Genetically Modified Organisms Expressing the Detoxification Gene from Clonostachys rosea. // APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, June 2004, p.3239-3245 Vol.70, No.6.

23. Taylor M.J., Pang V.F., Beasley V.R. (1989) The immunotoxicity of trichothecene mycotoxins // In: Trichotecene Mycotoxicosis: Pathophysiological effects, Vol II, pp. 1-37, Beasley., V.R.,(ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, USA.

24. Wyatt R.D., Doerr J.A., Hamilton P.B., Burmeister H.R. Egg Production, Shell Thickness, and Other Physiological Parameters of Laying Hens Affected by T-2 Toxin // Appl. Microbiol. -1975. - 29, No.5. - P.641-645.

 

 

Нивы Зауралья, №10, ноябрь 2007 года

Наверх